Citometría tisular

La citometría de imágenes tisulares o citometría tisular es un método de histopatología digital que combina la patología digital clásica (escaneo de portaobjetos de vidrio y generación de portaobjetos virtuales) y la patología computacional (análisis digital) en un enfoque integrado con soluciones para todo tipo de enfermedades, tejidos y tipos celulares, así como marcadores moleculares y los métodos de tinción correspondientes para visualizar estos marcadores. La citometría tisular utiliza portaobjetos virtuales, que pueden generarse mediante múltiples escáneres de portaobjetos disponibles comercialmente, así como software de análisis de imágenes específico, que preferiblemente incluye algoritmos de aprendizaje automático y aprendizaje profundo . ^{[ 1 ]} La citometría tisular permite el análisis celular dentro de tejidos gruesos, conservando información morfológica y contextual, incluida información espacial sobre subpoblaciones celulares definidas. ^{[ 2 ]}

En este proceso, una muestra de tejido, ya sea fijada en formalina e incluida en parafina (FFPE) o sección de tejido congelado, también denominada "criocorte", se etiqueta con marcadores inmunohistoquímicos ^{[ 3 ]} (IHC) o inmunofluorescentes , se escanea con escáneres de portaobjetos de alto rendimiento y los datos recopilados de portaobjetos virtuales se procesan y analizan utilizando un software que puede identificar células individuales en el contexto del tejido automáticamente y distinguir entre núcleo y citoplasma para cada célula. ^{[ 1 ]} Los algoritmos adicionales pueden identificar membranas celulares, estructuras subcelulares (como fibras del citoesqueleto, vacuolas , nucléolos) y/o estructuras de tejido multicelular (glándulas, glomérulos , epidermis o focos tumorales). ^{[ 4 ]} La clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) es un método de análisis que mide señales de fluorescencia en células individuales, donde la señal proviene de técnicas de tinción mediadas por anticuerpos y fenotipos detectados por citometría de flujo . ^{[ 5 ]} La principal limitación de la citometría de flujo es que solo puede aplicarse —como su nombre indica— a células en solución. Aunque existen métodos para "solubilizar" tejido sólido, cualquier procesamiento de este tipo destruye irrevocablemente la arquitectura del tejido y cualquier contexto espacial. Por lo tanto, la citometría tisular complementa el uso de la citometría de flujo y el microscopio de fluorescencia ^{[ 6 ]} en la investigación básica, la práctica clínica y los ensayos clínicos, al proporcionar análisis similares a FACS en secciones de tejido sólido (así como cultivos celulares adherentes) in situ. La ventaja de la citometría tisular frente a la citometría de flujo es que no requiere que las células estén suspendidas en un fluido, lo que ayuda a mantener la integridad de la estructura, la morfología y la información contextual del tejido, facilitando así un análisis contextual preciso y exacto que no es posible con la citometría de flujo.

La inmunohistoquímica se utiliza en la práctica clínica, donde se recolectan biopsias de tejido de cada paciente con posible cáncer, se fijan en formalina y se incluyen en parafina. Estas secciones de tejido se cortan en serie en un micrótomo para obtener secciones delgadas, que representan el material diagnóstico para los diagnósticos clínicos. ^{[ 3 ]} Una vez teñidas inicialmente con hematoxilina y eosina para detectar células cancerosas, se realiza tinción con múltiples marcadores para la proliferación, el linaje, el pronóstico y los objetivos oncogénicos. Los patólogos utilizan un microscopio óptico para la evaluación a través de los objetivos y concluyen el diagnóstico puntuando la tinción en porcentaje o como positiva/negativa. La evaluación visual proporciona un diagnóstico subjetivo y un plan de tratamiento.

Al convertir las láminas de vidrio en imágenes digitales, la patología digital transformó la forma en que los patólogos interactuaban con las muestras de tejido. Sin embargo, la fase inicial de la patología digital se centró principalmente en la visualización y el intercambio de imágenes. Si bien esto permitió las consultas remotas y facilitó el archivo de imágenes, no alteró fundamentalmente el proceso central de la patología: la interpretación manual de la morfología tisular por expertos humanos.

Se diseñó un sistema más robusto y automatizado para realizar análisis similares a la citometría de flujo en células inmunoteñidas en un tejido fijado, denominado citometría tisular. ^{[ 7 ]} La técnica se introdujo en la década de 1990 basándose en patentes de Steiner y Ecker, ^{[ 8 ]} que describían un procedimiento para el "Análisis citométrico de diversas poblaciones celulares en secciones de tejido o cultivos celulares visualizados mediante colorantes fluorescentes y/o cromógenos ". La citometría tisular surgió como una extensión transformadora de la patología digital, prometiendo cerrar la brecha entre el análisis basado en imágenes y los conocimientos cuantitativos basados ​​en datos. En esencia, la citometría tisular permite el análisis automatizado y cuantitativo de las características celulares y tisulares. Mediante el empleo de algoritmos computacionales y modelos de aprendizaje automático, puede segmentar con precisión los núcleos, identificar los tipos de células y cuantificar los niveles de expresión de proteínas dentro del contexto tisular.

Hernani et al. presentaron patentes adicionales a principios del siglo XXI para realizar citometría de flujo virtual en tejido inmunoteñido. ^{[ 9 ]} Los fundamentos de esta última derivaron del procedimiento presentado en 1982 por Gillete et al., que describía el análisis cualitativo de mezclas espectrales mediante análisis factorial junto con una biblioteca de referencia espectral. ^{[ 10 ]} Tras este estudio, Zhou R et al. publicaron un método para cuantificar la fosfatasa ácida específica de la próstata (PSAP) en secciones histológicas de tumores de próstata con la técnica del complejo peroxidasa-antiperoxidasa (PAP) utilizando diaminobencidina (DAB) como sustrato. ^{[ 11 ]}

La integración de la IA y el aprendizaje automático ha sido fundamental en el desarrollo de la citometría tisular. Por ejemplo, los algoritmos basados ​​en IA pueden entrenarse para identificar tipos celulares específicos, detectar cambios morfológicos sutiles asociados a enfermedades o cuantificar la densidad de células inmunitarias dentro de un microambiente tumoral . ^{[ 12 ]}

Al delimitar con precisión los núcleos individuales, los investigadores pueden extraer información valiosa sobre el tamaño, la forma y la textura nuclear, que puede correlacionarse con diversas afecciones patológicas. Del mismo modo, los algoritmos de segmentación de tejidos permiten identificar diferentes compartimentos tisulares, como el tumor, el estroma y el infiltrado inmunitario, facilitando el análisis de las relaciones espaciales entre los componentes celulares. ^{[ 13 ]}

Un citómetro de tejidos consta de dos componentes principales: (I) un escáner de alto rendimiento para adquirir imágenes virtuales de alta calidad de secciones de tejido marcadas con marcadores inmunohistoquímicos y/o fluorescentes, y (II) un software para el análisis de imágenes y la interpretación de datos. Los citómetros de tejidos modernos pueden analizar miles de células dentro de la muestra de tejido en tiempo real.

Microambiente tumoral: La citometría tisular se utiliza ampliamente en la investigación para caracterizar el microambiente tumoral, incluyendo, por ejemplo, la identificación del panorama inmunitario o la vascularización tumoral, dentro de secciones de tejido procesadas mediante IHC/IF. Una razón es que, al utilizar esta tecnología, la compleja arquitectura tisular permanece intacta y, por lo tanto, también se pueden analizar las relaciones espaciales entre fenotipos celulares y/o estructuras multicelulares. ^{[ 14 ]}

Mediante la citometría tisular, varios grupos de investigación pudieron demostrar el impacto de diversas subpoblaciones de células inmunitarias (CD4, CD68 , CD8, CD20, Foxp3, PD1) en la supervivencia de pacientes con distintos tipos de cáncer (p. ej., cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer gástrico, melanoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas). ^{[ 14 ]} Dado que en la terapia oncológica una estrategia de tratamiento novedosa consiste en dirigirse a los puntos de control inmunitarios (moléculas que inhiben la reacción inmunitaria antitumoral), los conocimientos obtenidos mediante la citometría tisular pueden ayudar a encontrar nuevas moléculas/biomarcadores diana, así como a determinar la mejor estrategia de tratamiento para los pacientes. ^{[ 14 ]}

Inmunología : El contexto de las células inmunitarias es importante para delinear la etimología de las enfermedades inflamatorias, que a menudo resultan de una función alterada de las células inmunitarias adaptativas y/o innatas. La citometría tisular es útil para detectar y localizar células específicas, especialmente poblaciones heterogéneas, dentro de su entorno tisular nativo e identificar las señales detrás de la enfermedad. ^{[ 15 ]} Por ejemplo, se utilizó para investigar enfermedades relacionadas con IgG4: un artículo informa sobre la mediastinitis fibrosante impulsada por CTL CD4+ en lugar de células Th2 donde la infiltración de CTL CD4+ se ilustró mediante citometría tisular. ^{[ 16 ]} Estudios de seguimiento investigaron cómo las células T foliculares influyen en los eventos de cambio de clase de células B en la enfermedad relacionada con IgG4 y la enfermedad de Kimura; los investigadores encontraron una correlación entre las células B AICDA+CD19+ y la expresión de IgG4 utilizando citometría tisular. ^{[ 17 ]}

Caracterización de células madre mesenquimales : Las células madre mesenquimales (CMM) son células multipotentes con capacidad de diferenciarse en varios subtipos, como hueso, cartílago, músculo, dientes en desarrollo y tejido adiposo, lo que tiene importancia clínica para la medicina regenerativa. ^{[ 18 ]} Sin embargo, aunque existen criterios fenotípicos mínimos definidos, las CMM, debido a su naturaleza heterogénea, necesitan ser caracterizadas con mayor detalle en cuanto a sus biomarcadores específicos. ^{[ 19 ]} La citometría tisular resulta prometedora para describir los biomarcadores de las CMM quiescentes y, además, caracterizar el efecto del hialuronano en esta población. ^{[ 20 ]} La citometría tisular también puede utilizarse para investigar la interacción de las CMM con el glioblastoma: para caracterizar la fusión celular, la transferencia de vesículas extracelulares y las comunicaciones intercelulares. ^{[ 21 ]} Adicionalmente, la citometría tisular se utiliza para obtener imágenes del hipocampo murino y visualizar la microglía M1/M2 en ratones con trasplante de CMM como modelo para la enfermedad de Alzheimer. ^{[ 22 ]}

COVID-19: La pandemia de COVID-19 requirió diversas herramientas para describir la progresión y la gravedad de la enfermedad. Mediante citometría tisular, los investigadores informaron sobre la interacción entre las células inmunitarias y el virus SARS-CoV-2 y su efecto en la enfermedad: por ejemplo, un estudio mostró que las células T citotóxicas CD4+ se expandieron significativamente en los pulmones en casos graves de COVID-19. ^{[ 23 ]} Otro hallazgo ilustra la pérdida de centros germinales en los ganglios linfáticos y el bazo en la COVID-19 aguda, lo cual se demostró mediante citometría de inmunofluorescencia multicolor. ^{[ 24 ]}

Neurociencia : El seguimiento de los procesos de neurodesarrollo es un campo de investigación activo en neurociencia. El análisis cuantitativo de tejidos se emplea ampliamente en este campo para determinar el papel de diferentes estímulos en el sistema nervioso. ^{[ 25 ] [ 26 ] [ 27 ] [ 28 ]} Un grupo de investigación informó sobre el efecto del campo magnético en la diferenciación neuronal de células madre pluripotentes, donde los efectos fenotípicos se observaron mediante citometría de tejidos. ^{[ 25 ]} Otra aplicación de la citometría de tejidos en neurociencia se mostró en un estudio diseñado para evaluar el efecto del estrés en las neuronas hipotalámicas. ^{[ 26 ]}