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transposón Tn3

El transposón Tn3 es un elemento genético móvil de 4957 pares de bases , presente en procariotas . Tn3 es relevante desde el punto de vista médico porque confiere resistencia a ...

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El transposón Tn3 es un elemento genético móvil de 4957 pares de bases , presente en procariotas . Tn3 es relevante desde el punto de vista médico porque confiere resistencia a los antibióticos a muchas bacterias patógenas . Se han identificado alrededor de 20 transposones relacionados en bacterias pertenecientes a al menos 50 géneros, la mayoría de los cuales son gramnegativos . Los genes conferidos por la familia Tn3 codifican la resistencia a la eritromicina , la tetraciclina y, más comúnmente, a la penicilina (en Tn1 y Tn2). [ 1 ]

Tn3 codifica tres proteínas:

Tn3 es un ejemplo de transposón replicativo (transposón de tipo copiar y pegar).

Inicialmente descubierta como un represor de la transposasa, la resolvasa también juega un papel en la facilitación de la replicación de Tn3 (Sherratt 1989).

El transposón está flanqueado por un par de repeticiones invertidas de 38 pb.

Mecanismo de replicación

Integración replicativa. Flecha azul = Transposón, triángulo verde = Sitio de reconocimiento de la endonucleasa.

Paso 1 – Integración replicativa

Esta primera etapa está catalizada por la transposasa.

El plásmido que contiene el transposón (el plásmido donante) se fusiona con un plásmido huésped (el plásmido diana). Durante este proceso, el transposón y un pequeño fragmento de ADN del huésped se replican. El producto final es un plásmido cointegrado que contiene dos copias del transposón.

Shapiro (1978) [ 2 ] propuso el siguiente mecanismo para este proceso:

  1. Se producen cuatro cortes de cadena simple: uno en cada cadena del plásmido donante y uno en cada cadena del plásmido diana.
  2. Los plásmidos donante y diana se ligan entre sí, pero existen dos regiones monocatenarias debido al posicionamiento de las escisiones originales.
  3. La replicación del ADN convierte las regiones monocatenarias en bicatenarias, utilizando la cadena existente como plantilla. Es en esta etapa donde se replica el transposón.
    Nota: El diagrama no pretende ser una representación precisa de la estructura 3D.

Los diagramas de la derecha ilustran cómo las posiciones de las escisiones conducen a la replicación de ciertas regiones una vez que los plásmidos se han fusionado.

Paso 2 – Resolución

La reacción catalizada por la resolvasa Tn3

Para separar las moléculas huésped y diana, la resolvasa Tn3 ejecuta una recombinación sitio-específica entre la copia antigua y la nueva del transposón en un sitio específico llamado res , que está presente en cada copia del transposón. Res tiene 114 pb de longitud y consta de 3 sub-sitios, denominados sitios I, II y III. Cada uno de estos sitios tiene longitudes diferentes (28, 34 y 25 pb, respectivamente) y están espaciados de forma desigual con 22 pb separando los sitios I y II y solo 5 pb entre los sitios II y III. Los sitios consisten en motivos de repetición invertida de 6 pb que flanquean una secuencia central de longitud variable. Estos motivos actúan como sitios de unión para la resolvasa, de modo que cada sitio se une a un dímero de resolvasa pero con afinidad variable y probablemente una arquitectura de complejo proteína-ADN ligeramente diferente. [ 3 ] [ 4 ] Los tres sub-sitios son esenciales para la recombinación.

En la recombinación, dos sitios res repetidos directamente, con dímeros de resolvasa unidos a cada subsitio, se unen para formar una gran estructura compleja llamada sinaptosoma . La resolvasa unida a los sitios II y III inicia el ensamblaje de este complejo. En esta estructura, cuya arquitectura exacta aún no está clara, dos sitios res se entrelazan de tal manera que yuxtaponen dos copias del sitio I, lo que permite que los dímeros de resolvasa unidos a cada sitio formen un tetrámero. Nuevamente, es la interacción entre los dímeros de resolvasa unidos a los sitios accesorios (sitios II y III) y la resolvasa en el sitio I la que provoca la sinapsis de los dos dímeros y la formación del tetrámero. Una vez formado el tetrámero, este se activa y las hebras de ADN superior e inferior se cortan simultáneamente en el centro del sitio I, con un saliente de 2 pb. El intercambio de hebras se produce mediante un mecanismo aún desconocido, con una rotación neta resultante de 180°. Al intercambio de hebras le sigue la religación (Stark et al., 1992). La recombinación entre dos sitios res repetidos directamente separa, o resuelve, el "cointegrado" en dos moléculas originales, cada una de las cuales contiene ahora una copia del transposón Tn3. Tras la resolución, estas dos moléculas permanecen unidas como un catenano simple de dos nodos que puede separarse fácilmente in vivo mediante una topoisomerasa de tipo II (Grindley 2002). El sistema de resolvasa de tipo silvestre requiere absolutamente un sustrato superenrollado y que los sitios de recombinación estén orientados en una repetición directa en la misma molécula de ADN. Sin embargo, se han aislado varios mutantes "desregulados" o "hiperactivos" que han perdido el requisito de los sitios accesorios. Estos mutantes son capaces de catalizar la recombinación solo entre dos copias del sitio I, lo que básicamente reduce el tamaño del sitio de recombinación de 114 pb a solo 28 pb. [ 5 ] [ 6 ] Además, estos mutantes no tienen requisitos de superenrollamiento ni de conectividad (Arnold et al., 1999) y se ha demostrado que funcionan en células de mamíferos. [ 7 ] Los mutantes de resolvasa hiperactivos han demostrado ser útiles hasta ahora para crear resolvasas con especificidad de secuencia alterada [ 8 ] pero también en trabajos estructurales. [ 9 ]

La reacción completa de recombinación de resolvasa puede reproducirse in vitro , requiriendo únicamente resolvasa, un ADN sustrato y cationes multivalentes, utilizando proteína de tipo silvestre o mutantes hiperactivos. [ 5 ] [ 10 ]

Si se siguen desarrollando, los mutantes de resolvasa hiperactivos podrían convertirse en una alternativa a Cre y FLP , los sistemas de recombinación más utilizados en biología molecular hasta la fecha.

Referencias

  1. ↑ Shapiro, James Alan, ed. (1983). Elementos genéticos móviles . Nueva York: Academic Press. ISBN 978-0-12-638680-6.
  2. ↑ Shapiro, James (abril de 1979). "Modelo molecular para la transposición y replicación del bacteriófago Mu y otros elementos transponibles" . PNAS . 76 ( 4): 1933– 1937. Bibcode : 1979PNAS...76.1933S . doi : 10.1073/pnas.76.4.1933 . PMC 383507. PMID 287033 .  
  3. ↑ Abdel-Meguid SS, Grindley ND, Templeton NS, Steitz TA (abril de 1984). "Escisión de la proteína de recombinación específica del sitio gamma delta resolvasa: el más pequeño de dos fragmentos se une al ADN específicamente" . Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 81 (7): 2001–5 . Bibcode : 1984PNAS...81.2001A . doi : 10.1073 / pnas.81.7.2001 . PMC 345424. PMID 6326096 .  
  4. ↑ Blake DG, Boocock MR, Sherratt DJ, Stark WM (septiembre de 1995). "Unión cooperativa de monómeros de resolvasa Tn3 a un sitio de unión funcionalmente asimétrico" . Curr. Biol . 5 (9): 1036–46 . doi : 10.1016/S0960-9822(95)00208-9 . PMID 8542280 . 
  5. 1 2 Arnold PH, Blake DG, Grindley ND, Boocock MR, Stark WM (marzo de 1999). "Mutantes de la resolvasa Tn3 que no requieren sitios de unión accesorios para la actividad de recombinación" . EMBO J. 18 ( 5): 1407–14 . doi : 10.1093/emboj/18.5.1407 . PMC 1171230. PMID 10064606 .  
  6. ↑ Burke ME, Arnold PH, He J, et al. (febrero de 2004). "Mutaciones activadoras de la resolvasa Tn3 que marcan interfaces importantes en la catálisis de la recombinación y su regulación". Mol. Microbiol . 51 (4): 937–48 . doi : 10.1046/j.1365-2958.2003.03831.x . PMID 14763971 .  
  7. ↑ Schwikardi M, Dröge P (abril de 2000). "Recombinación sitio-específica en células de mamíferos catalizada por mutantes de resolvasa gammadelta: implicaciones para la topología del ADN episomal" . FEBS Lett . 471 ( 2–3 ): 147–50 . doi : 10.1016/S0014-5793(00)01394-6 . PMID 10767411. S2CID 83750793 .  
  8. ↑ Akopian A, He J, Boocock MR, Stark WM (julio de 2003). "Recombinasas quiméricas con reconocimiento de secuencias de ADN diseñadas" . Proc . Natl. Acad. Sci. USA . 100 (15): 8688–91 . Bibcode : 2003PNAS..100.8688A . doi : 10.1073/pnas.1533177100 . PMC 166373. PMID 12837939 .  
  9. ↑ Li W, Kamtekar S, Xiong Y, Sarkis GJ, Grindley ND, Steitz TA (agosto de 2005). "Estructura de un tetrámero de resolvasa gammadelta sináptica unido covalentemente a dos ADN escindidos". Science . 309 (5738): 1210– 5. Bibcode : 2005Sci...309.1210L . doi : 10.1126/science.1112064 . PMID 15994378 . S2CID 84409916 .  
  10. ↑ Reed RR, Grindley ND (septiembre de 1981). "Recombinación sitio-específica mediada por transposones in vitro: escisión del ADN y enlace proteína-ADN en el sitio de recombinación". Cell . 25 ( 3): 721–8 . doi : 10.1016/0092-8674(81)90179-3 . PMID 6269756. S2CID 28410571 .  
  • Sherratt, DJ (1989). Tn3 y elementos transponibles relacionados: recombinación y transposición sitio-específicas. En Berg, DE, Howe, M. (eds) ADN móvil. Sociedad Americana de Microbiología, Washington, DC, págs.  163-184 .
  • Grindley, NDF (2002). El movimiento de elementos similares a Tn3: transposición y resolución de cointegrados. En Mobile DNA II, Craig, N., Craigie, R., Gellert, M. y Lambowitz, A. (eds.), pp. 272-302. ASM Press, Washington, DC, EE. UU.