proteasa TEV

La proteasa TEV ( EC 3.4.22.44 , endopeptidasa de inclusión nuclear del virus del grabado del tabaco ) es una proteasa de cisteína altamente específica de secuencia del virus del grabado del tabaco (TEV). ^{[ 1 ]} Es un miembro del clan PA de proteasas similares a la quimotripsina . ^{[ 2 ]} Debido a su alta especificidad de secuencia, la proteasa TEV se usa frecuentemente para la escisión controlada de proteínas de fusión in vitro e in vivo . ^{[ 3 ]} La secuencia consenso reconocida por la proteasa TEV es Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-|-Ser, donde "|" denota el enlace peptídico escindido . ^{[ 4 ]}

El virus del grabado del tabaco codifica su genoma completo como una única poliproteína masiva (350 kDa). Esta se escinde en unidades funcionales por tres proteasas: la proteasa P1 (1 sitio de escisión), la proteasa del componente auxiliar (1 sitio de escisión) y la proteasa TEV (7 sitios de escisión). ^{[ 1 ]} La proteasa TEV nativa también contiene un sitio de autoescisión interno. Este sitio se escinde lentamente para inactivar la enzima (se desconoce la razón fisiológica de esto).

La estructura de la proteasa TEV se ha resuelto mediante cristalografía de rayos X. ^{[ 5 ]} Está compuesta por dos barriles β y una cola C-terminal flexible, y muestra homología estructural con la superfamilia de proteasas quimotripsina ( clan PA , familia C4 según la clasificación MEROPS ). ^{[ 2 ]} Aunque homóloga a las serina proteasas celulares (como la tripsina , la elastasa , la trombina , etc.), la proteasa TEV utiliza una cisteína como su nucleófilo catalítico ^{[ 6 ]} (al igual que muchas otras proteasas virales).

La catálisis covalente se lleva a cabo con una tríada Asp-His-Cys , dividida entre los dos barriles (Asp en β1 e His y Cys en β2). ^{[ 7 ]} El sustrato se mantiene como una lámina β, formando una interacción antiparalela con la hendidura entre los barriles y una interacción paralela con la cola C-terminal. ^{[ 8 ]} Por lo tanto, la enzima forma un túnel de unión alrededor del sustrato y las interacciones de las cadenas laterales controlan la especificidad. ^{[ 5 ]}

La secuencia de escisión nativa preferida se identificó por primera vez examinando los sitios de corte en el sustrato de poliproteína nativa en busca de secuencias recurrentes. El consenso para estos sitios de corte nativos es ENLYFQ\S, donde '\' denota el enlace peptídico escindido . ^{[ 4 ]} Los residuos del sustrato se etiquetan de P6 a P1 antes del sitio de corte y P1' después del sitio de corte. Los primeros trabajos también midieron la escisión de una serie de sustratos similares para caracterizar la especificidad de la proteasa para la secuencia nativa. ^{[ 9 ] [ 10 ]}

Estudios posteriores han utilizado la secuenciación de sustratos clivados de un conjunto de secuencias aleatorias para determinar patrones de preferencia. ^{[ 11 ] [ 12 ]} Aunque ENLYFQ\S es la secuencia óptima, la proteasa es activa en mayor o menor medida en una gama de sustratos (es decir, muestra cierta promiscuidad de sustrato ). El clivaje más alto es de secuencias más cercanas al consenso EXLYΦQ\φ donde X es cualquier residuo, Φ es cualquier hidrófobo grande o mediano y φ es cualquier residuo pequeño hidrófobo o polar. Aunque esta secuencia es la óptima, las secuencias con residuos desfavorecidos en algunas posiciones aún pueden clivarse si el resto de la secuencia es óptima. ^{[ 10 ] [ 12 ]}

La especificidad se debe a la gran área de contacto entre la enzima y el sustrato. Las proteasas como la tripsina tienen especificidad por un residuo antes y después del enlace escindido debido a una hendidura de unión poco profunda con solo uno o dos bolsillos que se unen a las cadenas laterales del sustrato. Por el contrario, las proteasas virales como la proteasa TEV tienen una cola C-terminal larga que cubre completamente el sustrato para crear un túnel de unión. Este túnel contiene un conjunto de bolsillos de unión estrechos, de modo que cada cadena lateral del péptido sustrato (P6 a P1') se une a un sitio complementario (S6 a S1'). ^{[ 5 ]}

En particular, la cadena lateral del péptido P6-Glu contacta con una red de tres enlaces de hidrógeno; P5-Asn apunta hacia el disolvente, sin establecer interacciones específicas (de ahí la ausencia de consenso del sustrato en esta posición); P4-Leu está enterrada en una cavidad hidrofóbica; P3-Tyr se encuentra en una cavidad hidrofóbica con un enlace de hidrógeno corto en el extremo; P2-Phe también está rodeada de hidrófobos, incluyendo la cara de la histidina de la tríada; P1-Gln forma cuatro enlaces de hidrógeno; y P1'-Ser está solo parcialmente encerrada en un surco hidrofóbico poco profundo. ^{[ 5 ]}

Uno de los principales usos de esta proteína es la eliminación de etiquetas de afinidad de proteínas de fusión recombinantes purificadas . La razón para utilizar la proteasa TEV como herramienta bioquímica es su alta especificidad de secuencia. Esta especificidad permite la escisión controlada de proteínas cuando la secuencia de preferencia se inserta en bucles flexibles. También hace que la proteasa TEV sea relativamente no tóxica in vivo, ya que la secuencia reconocida rara vez aparece en las proteínas. ^{[ 13 ]}

Aunque el diseño racional ha tenido un éxito limitado en cambiar la especificidad de la proteasa, la evolución dirigida se ha utilizado para cambiar el residuo preferido ya sea antes ^{[ 14 ]} o después ^{[ 15 ] [ 16 ]} del sitio de escisión.

En desarrollos recientes, se ha diseñado una variante de proteasa TEV de nueva generación denominada Numacut mediante una combinación de diseño racional guiado por IA, análisis de redes alostéricas y mutagénesis inteligente. Esta variante demuestra una escisión eficiente y sin dejar rastro en los motivos ENLYFQ↓X, donde prácticamente todos los aminoácidos (excepto la prolina) son tolerados en la posición P1', lo que amplía significativamente su aplicabilidad biotecnológica. ^{[ 17 ]}

Sin embargo, la proteasa TEV tiene limitaciones como herramienta bioquímica. Es propensa a la desactivación por autocorte (autólisis), aunque esto puede eliminarse mediante una única mutación S219V en el sitio de corte interno. ^{[ 18 ]} La proteasa expresada sola también es poco soluble; sin embargo, se han realizado varios intentos para mejorar su solubilidad mediante evolución dirigida y diseño computacional. También se ha demostrado que la expresión puede mejorarse mediante la fusión con la proteína de unión a maltosa (MBP), que actúa como un socio que mejora la solubilidad. ^{[ 3 ]}

Una solución más reciente la ofrece la variante Numacut, que combina múltiples mutaciones estabilizadoras y que mejoran la solubilidad. Numacut se expresa con altos rendimientos en E. coli, presenta una solubilidad significativamente mejorada y se mantiene estable en un amplio rango de pH, concentraciones de sal y aditivos tampón. A diferencia de la enzima de tipo silvestre, también puede liofilizarse y almacenarse a temperatura ambiente, lo que amplía su aplicabilidad en entornos industriales y farmacéuticos. ^{[ 17 ]}

Se ha informado que la proteasa TEV muestra una pérdida de actividad de 10 veces a 4  °C. ^{[ 19 ]} La proteasa TEV muestra pérdida de actividad a temperaturas superiores a 34  °C. ^{[ 20 ]} La proteasa TEV original requería la presencia de un agente reductor para una alta actividad, lo que podría interferir con la función de las proteínas que contienen enlaces disulfuro. Después de la incorporación de varias mutaciones, las versiones posteriores de la "superproteasa TEV" son altamente activas en presencia o ausencia de un agente reductor. ^{[ 21 ] [ 22 ] [ 23 ]}

El peso molecular de esta enzima varía entre 25 y 27 kDa dependiendo de la estructura específica utilizada.

• Poliproteína TEV en UniProt
• Proteasa TEV en MEROPS. Archivado el 3 de marzo de 2016 en Wayback Machine.
• Preguntas frecuentes sobre TEV del Instituto Nacional del Cáncer. Archivado el 22 de marzo de 2021 en Wayback Machine.