reacción en cadena de la polimerasa Touchdown

La reacción en cadena de la polimerasa de tipo touchdown o touchdown es un método de reacción en cadena de la polimerasa mediante el cual los cebadores evitan la amplificación de secuencias no específicas. ^{[ 1 ]} La temperatura de hibridación durante una reacción en cadena de la polimerasa determina la especificidad de la hibridación del cebador. El punto de fusión del cebador establece el límite superior de la temperatura de hibridación. A temperaturas ligeramente superiores a este punto, solo se producirá un apareamiento de bases muy específico entre el cebador y la plantilla. A temperaturas más bajas, los cebadores se unen con menor especificidad. La unión no específica del cebador enmascara los resultados de la reacción en cadena de la polimerasa, ya que las secuencias no específicas a las que se unen los cebadores en las primeras etapas de la amplificación "enmascararán" cualquier secuencia específica debido a la naturaleza exponencial de la amplificación de la polimerasa . ^[²^]

Método

{\displaystyle \Delta T} — Esquema de PCR de descenso de temperatura. La primera hibridación entre el cebador y el ADN ocurre a la temperatura inicial, la segunda después de que la temperatura se haya reducido por $\Delta T$ Por lo tanto, el producto del segundo recocido se ve perjudicado por $2^{-1}$ .

Los primeros pasos de un ciclo de reacción en cadena de la polimerasa con temperatura de hibridación descendente (touchdown) tienen temperaturas de hibridación elevadas. Esta temperatura se reduce gradualmente en cada ciclo posterior. El cebador se hibridará a la temperatura más alta que permita la menor unión inespecífica que pueda tolerar. Por lo tanto, la primera secuencia amplificada es la que se encuentra entre las regiones de mayor especificidad del cebador; es muy probable que esta sea la secuencia de interés. Estos fragmentos se amplificarán aún más durante las rondas posteriores a temperaturas más bajas, y competirán con las secuencias inespecíficas a las que los cebadores puedan unirse a dichas temperaturas. Si el cebador se une inicialmente (durante las fases de mayor temperatura) a la secuencia de interés, se pueden realizar rondas posteriores de reacción en cadena de la polimerasa sobre el producto para amplificar aún más esos fragmentos. La técnica touchdown aumenta la especificidad de la reacción a temperaturas más altas y aumenta la eficiencia hacia el final al reducir la temperatura de hibridación. ^{[ 3 ]}

Desde un punto de vista matemático, los productos del recocido a temperaturas más bajas se ven perjudicados por: $2^{ij}$ para el primer recocido en el ciclo $i$ y el segundo del ciclo $j$ para $i,j\in \mathbb {N} ,i\geq j$ .

Referencias

↑ Don R, Cox P, Wainwright B, Baker K, Mattick J (1991). "PCR 'Touchdown' para evitar el cebado espurio durante la amplificación genética" . Nucleic Acids Res . 19 (14): 4008. doi : 10.1093/nar/19.14.4008 . PMC 328507. PMID 1861999 .
↑ Hecker K, Roux K (1996). "Las temperaturas de hibridación altas y bajas aumentan tanto la especificidad como el rendimiento en la PCR de descenso gradual y gradual" . BioTechniques . 20 (3): 478– 85. doi : 10.2144/19962003478 . PMID 8679209 .
↑ Roux K (1994). "Uso de pares de cebadores y plantillas no coincidentes en la PCR de descenso de temperatura". BioTechniques . 16 (5): 812– 4. PMID 8068332 .

[1] Don R, Cox P, Wainwright B, Baker K, Mattick J (1991). "PCR 'Touchdown' para evitar el cebado espurio durante la amplificación genética" . Nucleic Acids Res . 19 (14): 4008. doi : 10.1093/nar/19.14.4008 . PMC 328507. PMID 1861999 .

[2] Hecker K, Roux K (1996). "Las temperaturas de hibridación altas y bajas aumentan tanto la especificidad como el rendimiento en la PCR de descenso gradual y gradual" . BioTechniques . 20 (3): 478– 85. doi : 10.2144/19962003478 . PMID 8679209 .

[3] Roux K (1994). "Uso de pares de cebadores y plantillas no coincidentes en la PCR de descenso de temperatura". BioTechniques . 16 (5): 812– 4. PMID 8068332 .

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