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Transfección

La transfección es el proceso de introducir deliberadamente ácidos nucleicos desnudos o purificados en células eucariotas . [ 1 ] [ 2 ] También puede referirse a otros métodos y...

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La transfección es el proceso de introducir deliberadamente ácidos nucleicos desnudos o purificados en células eucariotas . [ 1 ] [ 2 ] También puede referirse a otros métodos y tipos de células, aunque a menudo se prefieren otros términos: " transformación " se usa típicamente para describir la transferencia de ADN no viral en bacterias y células eucariotas no animales , incluidas las células vegetales. En células animales, transfección es el término preferido, ya que el término "transformación" también se usa para referirse a la progresión de una célula a un estado canceroso ( carcinogénesis ). Transducción se usa a menudo para describir la transferencia de genes mediada por virus en células procariotas. [ 2 ] [ 3 ]

La palabra transfección es una combinación del prefijo trans- y la palabra "infección". El material genético (como el ADN plasmídico superenrollado o los constructos de siRNA ) puede ser transfectado. La transfección de células animales generalmente implica la apertura de poros transitorios o "agujeros" en la membrana celular para permitir la entrada del material. La transfección puede realizarse utilizando fosfato de calcio (es decir , fosfato tricálcico ), mediante electroporación , mediante compresión celular o mezclando un lípido catiónico con el material para producir liposomas que se fusionan con la membrana celular y depositan su carga en el interior.

La transfección puede dar lugar a morfologías y anomalías inesperadas en las células diana.

Terminología

El significado del término ha evolucionado. [ 4 ] El significado original de transfección era "infección por transformación", es decir, la introducción de material genético, ADN o ARN, de un virus o bacteriófago procariota en las células, lo que resulta en una infección. Para el trabajo con células bacterianas y arqueas, la transfección conserva su significado original como un caso especial de transformación. Debido a que el término transformación tenía otro sentido en la biología de las células animales (un cambio genético que permite la propagación a largo plazo en cultivo o la adquisición de propiedades típicas de las células cancerosas), el término transfección adquirió, para las células animales, su significado actual de un cambio en las propiedades celulares causado por la introducción de ADN.

Métodos

Existen diversos métodos para introducir ADN extraño en una célula eucariota : algunos se basan en tratamientos físicos (electroporación, compresión celular, nanopartículas , magnetofección); otros utilizan materiales químicos o partículas biológicas (virus) como transportadores. Se han desarrollado numerosos métodos de transferencia génica para diversos tipos de células y tejidos, desde bacterias hasta mamíferos. En general, estos métodos se pueden clasificar en tres categorías: físicos, químicos y biológicos. [ 5 ]

Los métodos físicos incluyen electroporación , microinyección , pistola génica , impalefección , presión hidrostática , infusión continua y sonicación. Los métodos químicos incluyen lipofección , un proceso de transfección de ADN mediado por lípidos que utiliza vectores liposomales. También puede incluir el uso de portadores de genes poliméricos (poliplexos). [ 6 ] La transfección biológica suele estar mediada por virus , aprovechando la capacidad de un virus para inyectar su ADN dentro de una célula huésped. Un gen que se pretende administrar se empaqueta en una partícula viral deficiente en replicación. Los virus utilizados hasta la fecha incluyen retrovirus , lentivirus , adenovirus , virus adenoasociado y virus del herpes simple .

Métodos físicos

Electroporador con formas de onda cuadrada y de decaimiento exponencial para aplicaciones de electroporación in vitro, in vivo, en células adherentes y en placas de 96 pocillos. Fabricado por BTX Harvard Apparatus, Holliston, MA, EE. UU.

Los métodos físicos son conceptualmente los más sencillos, ya que utilizan algún medio físico para introducir el material transfectado en el núcleo de la célula diana. El método físico más utilizado es la electroporación , en la que pulsos eléctricos cortos rompen la membrana celular, permitiendo que los ácidos nucleicos transfectados entren en la célula. [ 5 ] Otros métodos físicos utilizan diferentes medios para perforar la membrana celular: la sonoporación utiliza ultrasonido de alta intensidad (atribuido principalmente a la cavitación de burbujas de gas que interactúan con las membranas celulares cercanas), y la transfección óptica utiliza un láser altamente focalizado para formar un  orificio de aproximadamente 1 μm de diámetro. [ 7 ]

Varios métodos utilizan herramientas que fuerzan el ácido nucleico dentro de la célula, a saber: microinyección de ácido nucleico con una aguja fina; [ 5 ] administración de partículas biolísticas , en la que el ácido nucleico se une a partículas de metal pesado (generalmente oro) y se impulsa hacia las células a alta velocidad; [ 8 ] y magnetofección , donde los ácidos nucleicos se unen a partículas magnéticas de óxido de hierro y se dirigen hacia las células objetivo mediante imanes. [ 8 ]

La administración hidrodinámica es un método utilizado en ratones y ratas, en el que los ácidos nucleicos pueden administrarse al hígado mediante la inyección de un volumen relativamente grande en la sangre en menos de 10 segundos; casi todo el ADN se expresa en el hígado mediante este procedimiento. [ 9 ]

Métodos químicos

La transfección basada en productos químicos se puede dividir en varios tipos: ciclodextrina , [ 10 ] polímeros, [ 11 ] liposomas o nanopartículas [ 12 ] (con o sin funcionalización química o viral. Véase más abajo).

  • Uno de los métodos más económicos utiliza fosfato de calcio , descubierto originalmente por FL Graham y AJ van der Eb en 1973 [ 13 ] (véase también [ 14 ] ). Se combina una solución salina tamponada con HEPES (HeBS) que contiene iones fosfato con una solución de cloruro de calcio que contiene el ADN que se va a transfectar. Al combinarse, se forma un fino precipitado de calcio con carga positiva y fosfato con carga negativa, que se une al ADN que se va a transfectar en su superficie. La suspensión del precipitado se añade a las células que se van a transfectar (generalmente un cultivo celular en monocapa). Mediante un proceso que aún no se comprende del todo, las células absorben parte del precipitado y, con él, el ADN. Este proceso ha sido un método preferido para identificar muchos oncogenes. [ 15 ]
  • Otro método consiste en el uso de polímeros catiónicos como el DEAE-dextrano o la polietilenimina (PEI). El ADN, con carga negativa, se une al policatión y el complejo es absorbido por la célula mediante endocitosis .
  • La lipofección (o transfección con liposomas ) es una técnica que se utiliza para inyectar material genético en una célula mediante liposomas , que son vesículas que pueden fusionarse fácilmente con la membrana celular, ya que ambas están formadas por una bicapa de fosfolípidos . [ 16 ] La lipofección generalmente utiliza un lípido con carga positiva ( catiónico ) ( liposomas catiónicos o mezclas) para formar un agregado con el material genético con carga negativa ( aniónico ). [ 17 ] Esta tecnología de transfección realiza las mismas tareas que otros procedimientos bioquímicos que utilizan polímeros, DEAE-dextrano , fosfato de calcio y electroporación . La eficiencia de la lipofección puede mejorarse tratando las células transfectadas con un choque térmico suave . [ 18 ]
  • Fugene es una serie de reactivos de transfección no liposomales patentados y ampliamente utilizados, capaces de transfectar directamente una amplia variedad de células con alta eficiencia y baja toxicidad. [ 19 ] [ 20 ] [ 21 ] [ 22 ]
  • Los dendrímeros son una clase de moléculas altamente ramificadas basadas en diversos bloques de construcción y sintetizadas mediante un método convergente o divergente. Estos dendrímeros se unen a los ácidos nucleicos para formar dendriplejos que luego penetran en las células. [ 23 ] [ 24 ]

Métodos virales

El ADN también puede introducirse en las células utilizando virus como portadores. En estos casos, la técnica se denomina transducción y se dice que las células están transducidas. Los vectores adenovirales pueden ser útiles para los métodos de transfección viral porque pueden transferir genes a una amplia variedad de células humanas y tienen altas tasas de transferencia. [ 2 ] Los vectores lentivirales también son útiles debido a su capacidad para transducir células que no se encuentran en mitosis.

La fusión de protoplastos es una técnica en la que las células bacterianas transformadas se tratan con lisozima para eliminar la pared celular. Posteriormente, se utilizan agentes fusogénicos (por ejemplo, virus Sendai, PEG, electroporación) para fusionar el protoplasto que contiene el gen de interés con la célula receptora. Una desventaja importante de este método es que también introduce componentes bacterianos de forma inespecífica en la célula receptora.

Transfección estable y transitoria

La transfección estable y la transitoria difieren en sus efectos a largo plazo sobre la célula; una célula transfectada de forma estable expresará continuamente el ADN transfectado y lo transmitirá a las células hijas , mientras que una célula transfectada transitoriamente expresará el ADN transfectado durante un corto período de tiempo y no lo transmitirá a las células hijas.

Para algunas aplicaciones de transfección, basta con que el material genético transfectado se exprese solo transitoriamente. Dado que el ADN introducido en el proceso de transfección generalmente no se integra en el genoma nuclear, el ADN extraño se diluirá mediante mitosis o se degradará. [ 5 ] Las líneas celulares que expresan el antígeno nuclear 1 del virus de Epstein-Barr (EBNA1) o el antígeno T grande del SV40 permiten la amplificación episomal de plásmidos que contienen los orígenes de replicación virales del EBV (293E) o del SV40 (293T), lo que reduce considerablemente la tasa de dilución. [ 25 ]

Si se desea que el gen transfectado permanezca en el genoma de la célula y sus células hijas, debe producirse una transfección estable. Para lograrlo, se cotransfecta un gen marcador , que confiere a la célula alguna ventaja selectiva, como resistencia a una determinada toxina . Algunas (muy pocas) de las células transfectadas habrán integrado, por casualidad, el material genético extraño en su genoma. Si posteriormente se añade la toxina al cultivo celular, solo aquellas pocas células con el gen marcador integrado en sus genomas podrán proliferar , mientras que las demás morirán. Tras aplicar este estrés selectivo (presión selectiva) durante un tiempo, solo las células con una transfección estable permanecen y pueden seguir cultivándose. [ 26 ]

transfección de ARN

El ARN también puede transfectarse en células para expresar transitoriamente la proteína que codifica o para estudiar la cinética de degradación del ARN . La transfección de ARN se utiliza a menudo en células primarias que no se dividen.

Los siRNA también pueden transfectarse para lograr el silenciamiento del ARN (es decir, la pérdida de ARN y proteína del gen diana). Esto se ha convertido en una aplicación importante en la investigación para lograr la inactivación de proteínas de interés (por ejemplo, Endotelina-1 [ 27 ] ), con posibles aplicaciones en terapia génica. Las limitaciones de este enfoque de silenciamiento radican en la toxicidad de la transfección para las células y los posibles efectos no deseados sobre la expresión de otros genes o proteínas.

El ARN puede purificarse de las células después de la lisis o sintetizarse a partir de nucleótidos libres , ya sea químicamente o enzimáticamente, utilizando una ARN polimerasa para transcribir una plantilla de ADN . Al igual que el ADN, el ARN puede introducirse en las células por diversos medios, como la microinyección , la electroporación y la transfección mediada por lípidos . Si el ARN codifica una proteína , las células transfectadas pueden traducir el ARN en la proteína codificada. [ 28 ] Si el ARN es un ARN regulador (como un miRNA ), puede provocar otros cambios en la célula (como la inactivación génica mediada por ARN de interferencia ).

La encapsulación de la molécula de ARN en nanopartículas lipídicas supuso un gran avance para la producción de vacunas de ARN viables , resolviendo una serie de barreras técnicas clave en la administración de la molécula de ARN a la célula humana. [ 29 ] [ 30 ]

Las moléculas de ARN de menos de 25 nt (nucleótidos) evaden en gran medida la detección por parte del sistema inmunitario innato , que se activa ante moléculas de ARN más largas. La mayoría de las células del cuerpo expresan proteínas del sistema inmunitario innato, y al exponerse a moléculas de ARN largas exógenas, estas proteínas inician cascadas de señalización que provocan inflamación . Esta inflamación hipersensibiliza la célula expuesta y las células cercanas a exposiciones posteriores. Por lo tanto, si bien una célula puede transfectarse repetidamente con ARN corto con pocos efectos inespecíficos, la transfección repetida de células incluso con una pequeña cantidad de ARN largo puede causar la muerte celular a menos que se tomen medidas para suprimir o evadir el sistema inmunitario innato (véase "Transfección con ARN largo" más adelante).

La transfección con ARN corto se utiliza habitualmente en la investigación biológica para silenciar la expresión de una proteína de interés (mediante siRNA ) o para expresar o bloquear la actividad de un miRNA (mediante ARN corto que actúa independientemente de la maquinaria de ARN de interferencia de la célula y, por lo tanto, no se denomina siRNA). Si bien también se pueden utilizar vectores basados ​​en ADN ( virus , plásmidos ) que codifican una molécula de ARN corto, la transfección con ARN corto no conlleva el riesgo de modificar el ADN celular, una característica que ha propiciado el desarrollo del ARN corto como una nueva clase de fármacos macromoleculares . [ 31 ]

La transfección de ARN largo consiste en introducir deliberadamente moléculas de ARN de más de 25 nucleótidos en células vivas. Se distingue entre la transfección de ARN corto y largo porque las moléculas de ARN largo exógenas desencadenan una respuesta inmunitaria innata en las células que puede causar diversos efectos inespecíficos, como el bloqueo de la traducción , la detención del ciclo celular y la apoptosis .

ARN largo endógeno frente a ARN largo exógeno

El sistema inmunitario innato ha evolucionado para proteger contra las infecciones mediante la detección de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) y el desencadenamiento de un conjunto complejo de respuestas conocidas colectivamente como inflamación . Muchas células expresan receptores de reconocimiento de patrones (PRR) específicos para ARN exógeno, incluidos los receptores tipo Toll 3, 7 y 8 ( TLR3 , TLR7 , TLR8 ), [ 32 ] [ 33 ] [ 34 ] [ 35 ] la ARN helicasa RIG1 (RARRES3) , [ 36 ] la proteína quinasa R (PKR, también conocida como EIF2AK2), [ 37 ] [ 38 ] miembros de la familia de proteínas oligoadenilato sintetasa ( OAS1 , OAS2 , OAS3 ) y otros. Todas estas proteínas pueden unirse específicamente a moléculas de ARN exógeno y desencadenar una respuesta inmunitaria. Las características químicas, estructurales u otras características específicas de las moléculas de ARN largas que se requieren para el reconocimiento por los PRR siguen siendo en gran medida desconocidas a pesar de los intensos estudios. En un momento dado, una célula de mamífero típica puede contener varios cientos de miles de moléculas de ARNm y otras moléculas de ARN largo reguladoras . Cómo las células distinguen el ARN largo exógeno de la gran cantidad de ARN largo endógeno es una importante incógnita en biología celular . Varios estudios sugieren que la fosforilación del extremo 5' de una molécula de ARN largo puede influir en su inmunogenicidad , y específicamente que el ARN 5'-trifosfato, que puede producirse durante una infección viral, es más inmunogénico que el ARN 5'-difosfato, el ARN 5'-monofosfato o el ARN que no contiene fosfato en el extremo 5'. [ 39 ] [ 40 ] [ 41 ] [ 42 ] [ 43 ] [ 44 ] Sin embargo, el ARN largo transcrito in vitro (ivT) que contiene una caperuza de 7-metilguanosina (presente en el ARNm eucariota ) también es altamente inmunogénico a pesar de no tener fosfato 5', [ 45 ] lo que sugiere que otras características además de la fosforilación 5' pueden influir en la inmunogenicidad de una molécula de ARN.

El ARNm eucariota contiene nucleótidos modificados químicamente como N 6 -metiladenosina , 5-metilcitidina y nucleótidos 2'-O-metilados . Aunque solo un número muy pequeño de estos nucleótidos modificados está presente en una molécula típica de ARNm, pueden ayudar a prevenir que el ARNm active el sistema inmunitario innato al alterar la estructura secundaria que se asemejaría al ARN de doble cadena (dsRNA), [ 46 ] [ 34 ] un tipo de ARN que se cree que está presente en las células solo durante la infección viral. La inmunogenicidad del ARN largo se ha utilizado para estudiar tanto la inmunidad innata como la adaptativa .

Transfección repetida de ARN largo

La inhibición de tan solo tres proteínas ( interferón-β , STAT2 y EIF2AK2) es suficiente para proteger a los fibroblastos humanos de la muerte celular causada por la transfección frecuente con ARN largo codificante de proteínas. [ 45 ] La inhibición de la señalización del interferón interrumpe el bucle de retroalimentación positiva que normalmente hipersensibiliza a las células expuestas a ARN largo exógeno. Recientemente, los investigadores han utilizado esta técnica para expresar proteínas de reprogramación en fibroblastos humanos primarios . [ 47 ]

Véase también

Referencias

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Lecturas adicionales

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  • Luo D, Saltzman WM (enero de 2000). "Sistemas de administración de ADN sintético". Nature Biotechnology . 18 (1): 33– 7. doi : 10.1038/71889 . PMID 10625387. S2CID 7068508 .  
  • Bonetta L (2005). "Información privilegiada: evaluación de métodos de administración de genes" . Nature Methods . 2 (11): 875– 883. doi : 10.1038/nmeth1105-875 . S2CID 8078059 . 
  • Transfección en los Encabezamientos de Materias Médicas (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.
  • Recurso de investigación en biología  : artículos y foros sobre transfección.
  • Investigación en transfección óptica en la Universidad de St Andrews
  • El X Simposio Estados Unidos-Japón sobre Sistemas de Administración de Fármacos