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eficiencia de transformación

La eficiencia de transformación se refiere a la capacidad de una célula para captar e incorporar ADN exógeno, como plásmidos , durante un proceso denominado transformación . Est...

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La eficiencia de transformación se refiere a la capacidad de una célula para captar e incorporar ADN exógeno, como plásmidos , durante un proceso denominado transformación . Esta eficiencia se suele medir como el número de transformantes (células que han captado el ADN exógeno ) por microgramo de ADN añadido a las células. Una mayor eficiencia de transformación indica que más células pueden captar el ADN, mientras que una menor eficiencia indica que menos células pueden hacerlo.

En biología molecular , la eficiencia de transformación es un parámetro crucial. Se utiliza para evaluar la capacidad de diferentes métodos para introducir ADN plasmídico en las células y para comparar la eficiencia de distintos plásmidos , vectores y células huésped. Esta eficiencia puede verse afectada por diversos factores, como el método de introducción del ADN, el tipo de célula y plásmido utilizados, y las condiciones de la transformación. Por lo tanto, medir y optimizar la eficiencia de transformación es un paso importante en numerosas aplicaciones de biología molecular, como la ingeniería genética , la terapia génica y la biotecnología .

Medición

Al medir la eficiencia de transformación, podemos utilizar la información de nuestro experimento para evaluar la efectividad de la transformación. Esto cuantifica cuántas células fueron alteradas por 1  μg de ADN plasmídico. En esencia, es un indicador de que el experimento de transformación fue exitoso. [ 1 ] Debe determinarse en condiciones de exceso celular. [ 2 ]

La eficiencia de transformación se suele medir como el número de células transformadas por unidad de cantidad de células. Puede expresarse como un porcentaje o como unidades formadoras de colonias (UFC) por microgramo de ADN.

Una de las formas más comunes de medir la eficiencia de transformación es mediante un ensayo de formación de colonias . Aquí hay un ejemplo de cómo calcular la eficiencia de transformación utilizando unidades formadoras de colonias (UFC): [ 3 ]

  1. Siembra un número conocido de células en placas de agar que contengan los antibióticos adecuados.
  2. Incubar las placas durante un periodo de tiempo (normalmente toda la noche) a la temperatura y en las condiciones adecuadas para las células.
  3. Cuenta el número de colonias que crecen en las placas. Esto representa el número de células que han incorporado y expresado el ADN del plásmido.
  4. Para calcular la eficiencia de transformación, divida el número de colonias entre el número de células sembradas y multiplique el resultado por 100. El resultado será la eficiencia de transformación expresada como porcentaje.

Por ejemplo, si se siembran 1 × 10⁷ células y se cuentan 1000 colonias, la eficiencia de transformación es: (1000/1 × 10⁷ ) × 100 = 0,1 %.

Alternativamente, las UFC pueden reportarse por microgramo de ADN utilizado para la transformación. Esto se calcula multiplicando el número de colonias por el volumen del cultivo sembrado y dividiendo el resultado por la cantidad de ADN utilizada.

PCR cuantitativa (qPCR): Este método aprovecha el hecho de que el ADN plasmídico contiene un gen o secuencia específicos que no están presentes en el genoma de la célula huésped y, por lo tanto, pueden utilizarse como diana para la qPCR. Al cuantificar el número de copias de este gen o secuencia específicos en las células transformadas, es posible determinar la cantidad de ADN plasmídico presente en la célula y, por consiguiente, la eficiencia de la transformación. [ 4 ]

Ensayo de fluorescencia : Este método se basa en el uso de un plásmido que contiene una proteína fluorescente o un gen reportero . Las células transformadas se analizan mediante citometría de flujo o microscopía de fluorescencia para determinar el número de células que expresan la proteína fluorescente . La eficiencia de transformación se calcula como el porcentaje de células que expresan la proteína fluorescente. [ 5 ]

El número de células viables en una preparación para una reacción de transformación puede variar de 2 × 10⁸ a 10¹¹ ; los métodos más comunes de preparación de E. coli producen alrededor de 10¹⁰ células viables por reacción. Los plásmidos estándar utilizados para determinar la eficiencia de transformación en Escherichia coli son pBR322 u otros vectores de tamaño similar o menor, como la serie de vectores pUC. Sin embargo, se pueden utilizar diferentes vectores para determinar su eficiencia de transformación. Se pueden utilizar de 10 a 100 pg de ADN para la transformación; puede ser necesario más ADN para una transformación de baja eficiencia (generalmente, el nivel de saturación se alcanza con más de 10  ng). [ 6 ]

Tras la transformación, se siembran por separado el 1 % y el 10 % de las células. Estas pueden diluirse en el medio de cultivo según sea necesario para facilitar la siembra. Se puede utilizar una mayor dilución para lograr una transformación de alta eficiencia.

Una eficiencia de transformación de 1 × 10⁸ ufc /μg para un plásmido pequeño como pUC19 equivale aproximadamente a que se introduzca en las células 1 de cada 2000 moléculas del plásmido utilizado. En E. coli , el límite teórico de eficiencia de transformación para la mayoría de los plásmidos de uso común sería superior a 1 × 10¹¹ ufc/μg. En la práctica, el mejor resultado alcanzable puede rondar los 2–4 × 10¹⁰ ufc /μg para un plásmido pequeño como pUC19, y ser considerablemente menor para plásmidos grandes.

Factores que afectan la eficiencia de la transformación

Las células individuales son capaces de incorporar muchas moléculas de ADN, pero la presencia de múltiples plásmidos no afecta significativamente la ocurrencia de eventos de transformación exitosos. [ 7 ] Varios factores pueden afectar la eficiencia de la transformación: [ 2 ]

Tamaño del plásmido : Un estudio realizado en E. coli encontró que la eficiencia de transformación disminuye linealmente con el aumento del tamaño del plásmido , es decir, los plásmidos más grandes se transforman menos que los plásmidos más pequeños. [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]

Formas de ADN : Los plásmidos superenrollados tienen una eficiencia de transformación ligeramente mejor que los plásmidos relajados; estos últimos se transforman con una eficiencia de alrededor del 75 % de los superenrollados. [ 7 ] Sin embargo, el ADN lineal y monocatenario tiene una eficiencia de transformación mucho menor. Los ADN monocatenarios se transforman con una eficiencia 10⁴ menor que los bicatenarios.

Composición del medio : La composición del medio utilizado en el proceso de transformación puede afectar la eficiencia. Por ejemplo, ciertos suplementos del medio pueden aumentar la competencia natural de las células. [ 10 ]

Genotipo de las células : Las cepas de clonación pueden contener mutaciones que mejoran la eficiencia de transformación de las células. Por ejemplo, las cepas de E. coli K12 con la mutación deoR , que originalmente se descubrió que confería a la célula la capacidad de crecer en medios mínimos utilizando inosina como única fuente de carbono, tienen una eficiencia de transformación de 4 a 5 veces mayor que cepas similares sin ella. Para el ADN lineal, que se transforma con dificultad en E. coli , la mutación recBC o recD puede mejorar significativamente la eficiencia de su transformación. [ 11 ]

Condiciones de cultivo : Las células de E. coli son más susceptibles a volverse competentes cuando crecen rápidamente; por lo tanto, normalmente se cosechan en la fase logarítmica temprana del crecimiento celular al preparar células competentes. La densidad óptica óptima para la cosecha de células suele estar alrededor de 0,4, aunque puede variar según las diferentes cepas celulares. También se ha observado que un valor más alto, de 0,94 a 0,95, produce un buen rendimiento de células competentes, pero esto puede resultar poco práctico cuando el crecimiento celular es rápido. [ 12 ]

Presencia de antibióticos : La presencia de antibióticos puede aumentar la eficiencia de la transformación al inhibir el crecimiento de células no transformadas y seleccionar células transformadas resistentes al antibiótico. Por ejemplo, se ha demostrado que el uso de antibióticos β-lactámicos en bacterias productoras de glutamato aumenta su eficiencia de transformación. [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ]

Origen de replicación del plásmido : El origen de replicación del plásmido utilizado en el proceso de transformación puede afectar la eficiencia de diversas maneras. El número de copias del plásmido en la célula, la actividad del origen de replicación en las células huésped y la expresión de los genes del plásmido pueden influir en la eficiencia. Un plásmido con un origen de replicación de alto número de copias generalmente tendrá una mayor eficiencia de transfección que uno con un origen de baja copia; el uso de un plásmido con un origen de replicación activo en la célula huésped puede resultar en una mayor eficiencia de transfección. [ 16 ] [ 17 ]

Condiciones de transformación : el método de preparación de células competentes, la duración del choque térmico , la temperatura del choque térmico, el tiempo de incubación posterior al choque térmico, el medio de cultivo utilizado, el pH y diversos aditivos pueden afectar la eficiencia de transformación de las células. La presencia de contaminantes, así como de ligasa en una mezcla de ligación, puede reducir la eficiencia de transformación en la electroporación [ 18 ] , y puede ser necesaria la inactivación de la ligasa o la extracción de ADN con cloroformo para la electroporación; alternativamente, se puede usar solo una décima parte de la mezcla de ligación para reducir la cantidad de contaminantes. La preparación normal de células competentes puede producir una eficiencia de transformación que oscila entre 10⁶ y 10⁸ ufc /μg de ADN. Sin embargo, existen protocolos para métodos químicos que permiten obtener células supercompetentes que pueden producir una eficiencia de transformación superior a 1000 millones [ 19 ] .

Daño al ADN : La exposición del ADN a la radiación UV en el procedimiento estándar de electroforesis en gel de agarosa preparativa durante tan solo 45 segundos puede dañar el ADN, lo que puede reducir significativamente la eficiencia de la transformación. [ 20 ] Sin embargo, agregar citidina o guanosina al tampón de electroforesis a una concentración de 1 mM puede proteger el ADN del daño.  Se debe utilizar una radiación UV de mayor longitud de onda (365 nm), que causa menos daño al ADN, si es necesario trabajar con el ADN en un transiluminador UV durante un período prolongado. Esta longitud de onda UV más larga produce una fluorescencia más débil con el bromuro de etidio intercalado en el ADN; por lo tanto, si es necesario capturar imágenes de las bandas de ADN,  se puede utilizar una radiación UV de menor longitud de onda (302 o 312 nm). Sin embargo, dicha exposición debe limitarse a un tiempo muy corto si el ADN se va a recuperar posteriormente para la ligación y transformación.

Eficiencia de los métodos de transformación

El método utilizado para introducir el ADN tiene un impacto significativo en la eficiencia de la transformación. [ 21 ]

Electroporación

La electroporación tiende a ser más eficiente que los métodos químicos y puede aplicarse a una amplia gama de especies y cepas que anteriormente eran resistentes y recalcitrantes a las técnicas de transformación. [ 22 ] [ 23 ]

Se ha observado que la electroporación tiene un rendimiento promedio típico de entre 10⁴ y 10⁸ UFC /µg. Sin embargo, se han encontrado eficiencias de transformación tan altas como 0,5-5 × 10¹⁰ unidades formadoras de colonias (UFC) por microgramo de ADN para E. coli . Para muestras difíciles de manipular, como bibliotecas de ADNc , ADN genómico y plásmidos de más de 30 kb, se sugiere utilizar células electrocompetentes con eficiencias de transformación superiores a 1 × 10¹⁰ UFC/µg. Esto garantizará una alta tasa de éxito en la introducción del ADN y la formación de un gran número de colonias. [ 24 ] Es importante ajustar y optimizar el tampón de electroporación (aumentar la concentración del tampón de electroporación puede resultar en mayores eficiencias de transformación) y la forma, fuerza, número y número de pulsos; estos parámetros eléctricos desempeñan un papel clave en la eficiencia de transformación. [ 25 ]

Transformación química

La transformación química o el choque térmico pueden realizarse en un laboratorio sencillo, obteniéndose generalmente eficiencias de transformación adecuadas para aplicaciones de clonación y subclonación, aproximadamente 10⁶ UFC /μg. Uno de los primeros métodos empleados fue una combinación de CaCl₂ y MgCl₂ para tratar las células. Sin embargo, estos métodos dieron como resultado eficiencias de transformación con un máximo de 10⁵ - 10⁶ unidades formadoras de colonias (UFC) por microgramo de ADN plasmídico. [ 24 ] Investigaciones posteriores descubrieron que ciertos cationes, como Mn²⁺ , Ca²⁺ , Ba²⁺ , Sr²⁺ y Mg²⁺ , podían tener un efecto positivo en las eficiencias de transformación, siendo el Mn²⁺ el que mostró el mayor efecto. [ 26 ]

Barreras restrictivas para una transformación eficiente

Algunas células bacterianas poseen sistemas de restricción-modificación que pueden degradar plásmidos exógenos ajenos a la célula huésped. Esto puede reducir considerablemente la eficiencia de la transformación. [ 27 ] [ 21 ] Esto se debe a los sistemas de restricción presentes en las células receptoras, que atacan y destruyen el ADN exógeno. Estos sistemas reconocen el ADN exógeno basándose en las diferencias en los patrones de metilación. Para abordar este problema, se han aplicado estrategias como la alteración de la metilación del ADN exógeno mediante metilasas comerciales o la reducción de la actividad de restricción en las células receptoras. [ 28 ] [ 29 ] Por ejemplo, el uso de mutantes con metilación negativa o la inactivación temporal del sistema de restricción mediante calor pueden reducir la capacidad de la célula receptora para imponer restricciones al ADN exógeno. [ 30 ]

Véase también

Referencias

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  • Calculadora de eficiencia de transformación bacteriana