Secuenciación de transposones

La secuenciación por inserción de transposones ( Tn-seq ) combina la mutagénesis por inserción de transposones con la secuenciación masivamente paralela (MPS) de los sitios de inserción de transposones para identificar genes que contribuyen a una función de interés en bacterias . El método se estableció originalmente mediante el trabajo simultáneo en cuatro laboratorios bajo los acrónimos HITS, ^{[ 1 ]} INSeq, ^{[ 2 ]} TraDIS, ^{[ 3 ]} y Tn-Seq. ^{[ 4 ]} Posteriormente se han desarrollado numerosas variaciones y se han aplicado a diversos sistemas biológicos. En conjunto, los métodos se denominan a menudo Tn-Seq, ya que todos implican el seguimiento de la aptitud de los mutantes por inserción de transposones mediante enfoques de secuenciación de ADN . ^{[ 5 ]}

Los transposones son segmentos de ADN discretos y altamente regulados que pueden reubicarse dentro del genoma. Son universales y se encuentran en Eubacterias , Arqueas y Eucariotas , incluidos los humanos. Los transposones tienen una gran influencia en la expresión génica y pueden usarse para determinar la función de los genes. De hecho, cuando un transposón se inserta en un gen, la función de este se ve alterada. ^{[ 6 ]} Debido a esta propiedad, los transposones se han manipulado para su uso en mutagénesis por inserción. ^{[ 7 ]} El desarrollo de la secuenciación del genoma microbiano fue un gran avance para el uso de la mutagénesis por transposones. ^{[ 8 ] [ 9 ]} La función afectada por la inserción de un transposón puede vincularse al gen alterado mediante la secuenciación del genoma para localizar el sitio de inserción del transposón. La secuenciación masiva en paralelo permite la secuenciación simultánea de los sitios de inserción de transposones en grandes mezclas de diferentes mutantes. Por lo tanto, el análisis de todo el genoma es factible si los transposones se encuentran posicionados a lo largo del genoma en una colección de mutantes. ^{[ 5 ]}

La secuenciación de transposones requiere la creación de una biblioteca de inserciones de transposones, que contendrá un grupo de mutantes que, en conjunto, presentan inserciones de transposones en todos los genes no esenciales. La biblioteca se cultiva bajo una condición experimental de interés. Los mutantes con transposones insertados en genes necesarios para el crecimiento bajo la condición de prueba disminuirán en frecuencia con respecto a la población. Para identificar los mutantes que se pierden, las secuencias genómicas adyacentes a los extremos de los transposones se amplifican mediante PCR y se secuencian mediante MPS para determinar la ubicación y abundancia de cada mutación de inserción. La importancia de cada gen para el crecimiento bajo la condición de prueba se determina comparando la abundancia de cada mutante antes y después del crecimiento bajo la condición examinada. Tn-seq es útil tanto para el estudio de la aptitud de un solo gen como para el estudio de las interacciones génicas ^{[ 10 ].}

La mutagénesis con etiquetas de firma (STM) es una técnica antigua que también implica agrupar mutantes de inserción de transposones para determinar la importancia de los genes alterados bajo condiciones de crecimiento selectivas. ^{[ 11 ]} Las versiones de alto rendimiento de STM utilizan microarrays genómicos, que son menos precisos y tienen un rango dinámico menor que la secuenciación masivamente paralela. ^{[ 5 ]} Con la invención de la secuenciación de próxima generación, los datos genómicos se volvieron cada vez más accesibles. Sin embargo, a pesar del aumento en los datos genómicos, nuestro conocimiento de la función de los genes sigue siendo el factor limitante en nuestra comprensión del papel que desempeñan los genes. ^{[ 12 ] [ 13 ]} Por lo tanto, era necesario un enfoque de alto rendimiento para estudiar las relaciones genotipo-fenotipo como Tn-seq.

La secuenciación por transposones comienza transduciendo poblaciones bacterianas con elementos transponibles mediante bacteriófagos . Tn-seq utiliza el transposón Himar I Mariner, un transposón común y estable. Tras la transducción, el ADN se corta y la secuencia insertada se amplifica mediante PCR . Los sitios de reconocimiento para MmeI, una endonucleasa de restricción de tipo IIS , pueden introducirse mediante un cambio de un solo nucleótido en las repeticiones terminales del transposón Mariner. ^{[ 14 ]} Se encuentra a 4 pares de bases antes del final de la repetición terminal.

MmeI realiza un corte escalonado de 2 pares de bases 20 bases corriente abajo del sitio de reconocimiento de MmeI. ^{[ 15 ]}

Cuando MmeI digiere el ADN de una biblioteca de mutantes con inserción de transposones, se produce ADN fragmentado que incluye los transposones izquierdo y derecho y 16 pares de bases de ADN genómico circundante. El fragmento de 16 pares de bases es suficiente para determinar la ubicación de la inserción del transposón en el genoma bacteriano . La ligación del adaptador (secuencia utilizada para unirse a la celda de flujo) se facilita mediante el saliente de 2 bases. Se utilizan un cebador específico para el adaptador y un cebador específico para el transposón para amplificar la secuencia mediante PCR. El producto de 120 pares de bases se aísla mediante purificación en gel de agarosa o PAGE. Posteriormente, se utiliza la secuenciación masiva en paralelo para determinar las secuencias de los 16 pares de bases flanqueantes. ^{[ 10 ]}

La función del gen se deduce tras observar los efectos de la inserción sobre la función del gen en determinadas condiciones.

A diferencia de la secuenciación profunda de inserción de alto rendimiento (HITS) y la secuenciación de sitios de inserción dirigida por transposones (TraDIS), Tn-seq es específico del transposón Himar I Mariner y no se puede aplicar a otros transposones o elementos de inserción. ^{[ 10 ]} Sin embargo, el protocolo de Tn-seq requiere menos tiempo . HITS y TraDIS utilizan una técnica de fragmentación de ADN que produce una gama de tamaños de productos de PCR que podrían causar que las plantillas de ADN más cortas se amplifiquen preferentemente sobre las más largas. Tn-seq produce un producto de tamaño uniforme, lo que reduce la posibilidad de sesgo de PCR. ^{[ 10 ]}

Tn-seq puede utilizarse para identificar tanto la aptitud de genes individuales como para mapear interacciones génicas en microorganismos. Los métodos existentes para este tipo de estudios dependen de microarrays genómicos o de matrices de inactivación génica preexistentes, mientras que Tn-seq no. La utilización de secuenciación masivamente paralela por parte de Tn-seq hace que esta técnica sea fácilmente reproducible, sensible y robusta. ^{[ 10 ]}

La técnica Tn-seq ha demostrado ser útil para identificar nuevas funciones génicas. Su alta sensibilidad permite determinar relaciones fenotipo-genotipo que podrían haber sido consideradas insignificantes por métodos menos sensibles. Tn-seq identificó genes y vías esenciales para la utilización del colesterol en Mycobacterium tuberculosis . ^{[ 16 ]}

Tn-seq se ha utilizado para estudiar la organización genómica de orden superior mediante interacciones génicas. Los genes funcionan como una red altamente interconectada . Por lo tanto, para estudiar el impacto de un gen en el fenotipo , también deben considerarse las interacciones génicas . Tn-seq se utilizó para determinar las interacciones entre cinco genes de consulta y el resto del genoma en Streptococcus pneumoniae , lo que reveló epistasis tanto positiva como negativa. ^{[ 4 ] [ 10 ]}

Tn-seq utilizado en combinación con RNA-seq puede utilizarse para examinar el papel de las regiones de ADN no codificante . ^{[ 17 ]}