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Espectroscopia de resonancia magnética nuclear de triple resonancia

Los experimentos de triple resonancia son un conjunto de experimentos de espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) multidimensional que vinculan tres tipos de núcleos...

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Los experimentos de triple resonancia son un conjunto de experimentos de espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) multidimensional que vinculan tres tipos de núcleos atómicos , generalmente compuestos por 1H , 15N y 13C . Estos experimentos se utilizan a menudo para asignar señales de resonancia específicas a átomos específicos en una proteína enriquecida isotópicamente. La técnica fue descrita por primera vez en artículos de Ad Bax , Mitsuhiko Ikura y Lewis Kay en 1990, [ 1 ] [ 2 ] y posteriormente se añadieron más experimentos al conjunto. Muchos de estos experimentos se han convertido desde entonces en el conjunto estándar de experimentos utilizados para la asignación secuencial de resonancias de RMN en la determinación de la estructura de proteínas mediante RMN . Ahora son una parte integral del estudio de proteínas mediante RMN en solución, y también pueden utilizarse en RMN de estado sólido . [ 3 ] [ 4 ]

Fondo

Hay dos métodos principales para determinar la estructura de las proteínas a nivel atómico. El primero es la cristalografía de rayos X , que comenzó en 1958 cuando se determinó la estructura cristalina de la mioglobina . El segundo método es la RMN, que comenzó en la década de 1980 cuando Kurt Wüthrich describió el marco para la determinación de la estructura de las proteínas mediante RMN y resolvió la estructura de pequeñas proteínas globulares. [ 5 ] El método inicial de determinación estructural de proteínas mediante RMN se basaba en la espectroscopia de RMN homonuclear basada en protones, en la que el tamaño de la proteína que se puede determinar está limitado a ~10 kDa. Esta limitación se debe a la necesidad de asignar señales de RMN del gran número de núcleos en la proteína; en proteínas más grandes, el mayor número de núcleos produce un hacinamiento de resonancias, y el aumento del tamaño de la proteína también ensancha las señales, lo que dificulta la asignación de resonancias. Estos problemas pueden mitigarse mediante la espectroscopia de RMN heteronuclear , que permite editar el espectro de protones con respecto a los desplazamientos químicos de 15N y 13C , y también reduce la superposición de resonancias al aumentar el número de dimensiones del espectro. En 1990, Ad Bax y colaboradores desarrollaron la tecnología de triple resonancia y realizaron experimentos con proteínas marcadas isotópicamente con 15N y 13C , [ 1 ] con el resultado de que los espectros se simplifican drásticamente, facilitando enormemente el proceso de asignación de resonancias y aumentando el tamaño de la proteína que puede determinarse mediante RMN.

Estos experimentos de triple resonancia utilizan los acoplamientos magnéticos relativamente grandes entre ciertos pares de núcleos para establecer su conectividad. Específicamente, los acoplamientos 1 J NH , 1 J CH , 1 J CC y 1 J CN se utilizan para establecer la vía de conectividad escalar entre núcleos. El proceso de transferencia de magnetización se lleva a cabo a través de múltiples pasos eficientes de transferencia de magnetización de un enlace, en lugar de un solo paso a través de los acoplamientos 3 J HH , más pequeños y variables . El tamaño relativamente grande y la buena uniformidad de los acoplamientos de un enlace permitieron el diseño de esquemas de transferencia de magnetización eficientes que son efectivamente uniformes en una proteína dada, casi independientemente de la conformación. [ 3 ] Los experimentos de triple resonancia que involucran 31 P también pueden usarse para estudios de ácidos nucleicos . [ 6 ]

Conjunto de experimentos

Asignación secuencial mediante experimentos de triple resonancia
Las figuras superior e inferior muestran la trayectoria de transferencia de magnetización con los átomos que aparecen como picos resaltados. La figura central muestra cómo aparecen los picos en los espectros, aquí presentados como una superposición de franjas de espectros HNCACB y CBCA(CO)NH. Los picos de CBCA(CO)NH están en el gráfico de intensidad y coloreados de amarillo; identifican las resonancias de los Cα y Cβ precedentes. HNCACB está en el gráfico de contorno y generalmente muestra 4 picos para cada franja, dos de cada residuo y dos de su precedente. Los picos rojos son para Cα, y los picos azules para Cβ. Aquí, los picos azules de Cβ de treonina y alanina son distintivos y fácilmente identificables, mientras que la glicina, que carece de un Cβ, da un solo pico. Sin embargo, otros tipos de residuos pueden no ser tan fáciles de distinguir.

Estos experimentos suelen denominarse según los núcleos (H, N y C) implicados. CO se refiere al carbono carbonílico , mientras que CA y CB se refieren a Cα y Cβ respectivamente, y HA y HB a Hα y Hβ (véase el diagrama para ejemplos de experimentos). Los núcleos en el nombre están ordenados en la misma secuencia que en la ruta de transferencia de magnetización; los núcleos entre paréntesis participan en la ruta de transferencia de magnetización, pero no se registran. Por motivos de sensibilidad, estos experimentos generalmente comienzan y terminan en un protón, normalmente mediante pasos INEPT e INEPT inverso. Por lo tanto, muchos de estos experimentos son lo que se denomina experimentos de "ida y vuelta", donde, aunque no se indique en el nombre, la magnetización se transfiere de vuelta al protón inicial para la adquisición de la señal.

Algunos experimentos se utilizan en conjunto para la asignación de resonancias de proteínas; por ejemplo, HNCACB puede usarse junto con CBCA(CO)NH como un par de experimentos. No es necesario registrar todos estos experimentos para la asignación secuencial (puede hacerse con tan solo dos); sin embargo, pares de experimentos adicionales son útiles para evaluar de forma independiente la corrección de la asignación, y la redundancia de información puede ser necesaria cuando existe ambigüedad en las asignaciones. También se requieren otros experimentos para asignar completamente las resonancias de las cadenas laterales .

Existen versiones TROSY de muchos de estos experimentos para mejorar la sensibilidad. [ 7 ] Los experimentos de triple resonancia también se pueden utilizar en la asignación de resonancia de la cadena principal específica de la secuencia de espectros de RMN de giro en ángulo mágico en RMN de estado sólido . [ 4 ] [ 8 ]

Se han creado numerosos experimentos de RMN de triple resonancia, y la lista de experimentos que se presenta a continuación no pretende ser exhaustiva.

HNCO

El experimento proporciona las conectividades entre la amida de un residuo y el carbono carbonílico de los residuos precedentes. [ 2 ] Es el más sensible de los experimentos de triple resonancia. Las carboxamidas de las cadenas laterales de asparagina y glutamina también son visibles en este experimento. Además, el grupo guanidino de la arginina , que tiene una constante de acoplamiento similar a la del grupo carboxamida, también puede aparecer en este espectro. Este experimento se utiliza a veces junto con HN(CA)CO.

HN(CA)CO

Aquí, la resonancia amida de un residuo se correlaciona con el carbono carbonilo del mismo residuo, así como con el del residuo precedente. Las resonancias intra-residuo suelen ser más fuertes que las inter-residuo. [ 9 ]

HN(CO)CA

Este experimento correlaciona las resonancias de la amida de un residuo con el Cα del residuo precedente. Este experimento se utiliza frecuentemente junto con HNCA. [ 10 ]

HNCA

Este experimento correlaciona el desplazamiento químico de la amida de un residuo con el Cα del mismo residuo, así como con los del residuo precedente. [ 2 ] Cada tira produce dos picos: los picos Cα inter e intra-residuo. El pico del Cα precedente puede identificarse a partir del experimento HN(CO)CA, que solo proporciona el Cα inter-residuo.

CBCA(CO)NH

CBCA(CO)NH, o alternativamente HN(CO)CACB, correlaciona las resonancias de la amida de un residuo con los Cα y Cβ del residuo precedente. [ 11 ] Por lo tanto, se observan dos picos correspondientes a los Cα y Cβ para cada residuo. Este experimento se utiliza normalmente junto con HNCACB. La carboxamida de la cadena lateral de las glutaminas y asparaginas también aparece en este espectro en este experimento. CBCA(CO)NH se denomina a veces con mayor precisión (HBHA)CBCA(CO)NH, ya que comienza con protones alifáticos y termina en un protón amida, y por lo tanto no es un experimento de ida y vuelta como HN(CO)CACB.

HNCACB

HNCACB, o alternativamente CBCANH, correlaciona el desplazamiento químico de la amida de un residuo con los Cα y Cβ del mismo residuo, así como con los del residuo precedente. [ 12 ] En cada tira, pueden ser visibles cuatro picos  : 2 del mismo residuo y 2 del residuo precedente. Los picos del residuo precedente suelen ser más débiles y pueden identificarse utilizando CBCA(CO)NH. En este experimento, los picos Cα y Cβ están en fase opuesta, es decir, si Cα aparece como un pico positivo, entonces Cβ será negativo, lo que hace que la identificación de Cα y Cβ sea sencilla. La información adicional de Cβ del conjunto de experimentos CBCA(CO)NH/HNCACB hace que la identificación del tipo de residuo sea más fácil que HN(CO)CA/HNCA, sin embargo, HNCACB es un experimento menos sensible y puede no ser adecuado para algunas proteínas.

El experimento CBCANH es menos adecuado para proteínas de mayor tamaño, ya que es más susceptible al problema del ancho de línea que el HNCACB.

CBCACO(CA)HA

Este experimento proporciona las conectividades entre Cα y Cβ con el carbono carbonílico y los átomos Hα dentro del mismo residuo. [ 13 ] El grupo carboxilo de la cadena lateral del aspartato y el glutamato puede aparecer débilmente en este espectro.

CC(CO)NH

Este experimento proporciona conectividades entre la amida de un residuo y los átomos de carbono alifáticos del residuo precedente. [ 14 ]

H(CCO)NH

Este experimento proporciona información sobre las conexiones entre la amida de un residuo y los átomos de hidrógeno unidos al carbono alifático del residuo precedente.

HBHA(CO)NH

Este experimento correlaciona la resonancia amida con los Hα y Hβ del residuo precedente. [ 15 ]

Asignación secuencial

Normalmente se utilizan pares de experimentos para la asignación secuencial, por ejemplo, el par HNCACB y CBCA(CO)NH, o HNCA y HNC(CO)CA. Los espectros se analizan normalmente como franjas de picos, y las franjas del par de experimentos pueden presentarse juntas, una al lado de la otra, o como una superposición de dos espectros. En los espectros HNCACB, generalmente hay 4 picos en cada franja: los Cα y Cβ de un residuo, así como los del residuo precedente. Los picos del residuo precedente pueden identificarse a partir del experimento CBCA(CO)NH. Por lo tanto, cada franja de picos puede vincularse con la siguiente franja de picos de un residuo adyacente, lo que permite conectar las franjas secuencialmente. El tipo de residuo puede identificarse a partir de los desplazamientos químicos de los picos; algunos, como la serina , la treonina , la glicina y la alanina , son mucho más fáciles de identificar que otros. Posteriormente, se pueden asignar las resonancias comparando la secuencia de picos con la secuencia de aminoácidos de la proteína.

Referencias

  1. 1 2 Ikura M; Kay LE; Bax A (1990). "Un nuevo enfoque para la asignación secuencial de espectros de 1 H, 13 C y 15 N de proteínas: espectroscopia de RMN tridimensional de triple resonancia heteronuclear. Aplicación a la calmodulina". Biochemistry . 29 (19): 4659– 67. doi : 10.1021/bi00471a022 . PMID 2372549 . 
  2. 1 2 3 Lewis E Kay; Mitsuhiko Ikura; Rolf Tschudin, Ad Bax (1990). "Espectroscopia de RMN de triple resonancia tridimensional de proteínas enriquecidas isotópicamente". Journal of Magnetic Resonance . 89 (3): 496– 514. Bibcode : 1990JMagR..89..496K . doi : 10.1016/0022-2364(90)90333-5 .
  3. 1 2 Ad Bax (2011). "RMN de proteínas tridimensionales de triple resonancia: antes de que se convirtiera en una caja negra" . Journal of Magnetic Resonance . 213 (2): 442– 5. Bibcode : 2011JMagR.213..442B . doi : 10.1016/j.jmr.2011.08.003 . PMC 3235243. PMID 21885307 .  
  4. 1 2 Yongchao Su; Loren Andreas y Robert G. Griffin (2015). "RMN de proteínas con giro en ángulo mágico: polarización nuclear dinámica de alta frecuencia y detección de 1H". Annual Review of Biochemistry . 84 : 485–497 . doi : 10.1146/annurev-biochem-060614-034206 . PMID 25839340 .  – a través de Annual Reviews (se requiere suscripción)  
  5. ↑ Kurt Wüthrich (2001). "El camino hacia las estructuras de proteínas por RMN". Nature Structural Biology . 8 (11): 923– 925. doi : 10.1038/nsb1101-923 . PMID 11685234. S2CID 26153265 .  
  6. ↑ Gabriele Varani; Fareed Aboul-ela; Frederic Allain y Charles C. Gubser (1995). "Nuevos experimentos de resonancia triple tridimensional 1H − 13 C− 31 P para correlaciones secuenciales de la cadena principal en ácidos nucleicos". Journal of Biomolecular NMR . 5 (3): 315– 320. doi : 10.1007/BF00211759 . PMID 7540446 . S2CID 31239207 .  
  7. ↑ Michael Salzmann; Gerhard Wider; Konstantin Pervushin; Hans Senn y Kurt Wu1thrich (1999). "Experimentos de triple resonancia tipo TROSY para asignaciones secuenciales de RMN de proteínas grandes" (PDF) . Journal of the American Chemical Society . 121 (4): 844– 848. doi : 10.1021/ja9834226 .{{cite journal}}: CS1 maint: nombres numéricos: lista de autores ( enlace )
  8. ↑ Barbet-Massin; et al. (2014). "Asignación rápida de RMN con detección de protones para proteínas con giro rápido en ángulo mágico" . Journal of the American Chemical Society . 136 (35): 12489– 12497. doi : 10.1021/ja507382j . PMC 4156866. PMID 25102442 .   
  9. ↑ Robert T Clubb; V Thanabal; Gerhard Wagner (1992). "Un esquema de pulsos de triple resonancia tridimensional de tiempo constante para correlacionar los desplazamientos químicos intraresiduo 1 H N , 15 N y 13 C′ en proteínas marcadas con 15 N/ 13 C". Journal of Magnetic Resonance . 97 (1): 213– 217. Bibcode : 1992JMagR..97..213C . doi : 10.1016/0022-2364(92)90252-3 . hdl : 2027.42/30326 .
  10. ↑ Ad Bax y Mitsuhiko Ikura (1991). "Una técnica eficiente de RMN 3D para correlacionar las resonancias de amida del esqueleto de protón y 15 N con el carbono α del residuo precedente en proteínas uniformemente enriquecidas con 15 N/ 13 C". Journal of Biomolecular NMR . 1 (1): 99– 104. doi : 10.1007/BF01874573 . PMID 1668719. S2CID 20037190 .  
  11. ↑ Stephan Grzesiek, Ad Bax (1992). "Correlación de resonancias de amida del esqueleto y de la cadena lateral en proteínas más grandes mediante RMN de triple resonancia con múltiples repeticiones". Journal of the American Chemical Society . 114 (16): 6291– 6293. doi : 10.1021/ja00042a003 .
  12. ↑ Stephan Grzesiek, Ad Bax (1992). "Un experimento eficiente para la asignación secuencial de la cadena principal de proteínas isotópicamente enriquecidas de tamaño mediano" . Journal of Magnetic Resonance . 99 (1): 201– 207. Bibcode : 1992JMagR..99..201G . doi : 10.1016/0022-2364(92)90169-8 .
  13. ↑ Kay, Lewis E. (1993). "Experimento de RMN tridimensional con gradiente de campo pulsado para correlacionar los desplazamientos químicos de 13 Cα/β, 13 C' y 1 Hα en proteínas uniformemente marcadas con carbono-13 disueltas en agua". Journal of the American Chemical Society . 115 (5): 2055– 2058. doi : 10.1021/ja00058a072 .
  14. ↑ S. Grzesiek; J. Anglister; A. Bax (1993). "Correlación de resonancias de amida del esqueleto y de cadena lateral alifática en proteínas enriquecidas con 13 C/ 15 N mediante mezcla isotrópica de magnetización de 13 C" . Journal of Magnetic Resonance, Serie B. 101 ( 1): 114– 119. Bibcode : 1993JMRB..101..114G . doi : 10.1006/jmrb.1993.1019 .
  15. ↑ Stephan Grzesiek y Ad Bax (1993). "Determinación del tipo de aminoácido en el procedimiento de asignación secuencial de proteínas uniformemente enriquecidas con 13C/15N". Journal of Biomolecular NMR . 3 ( 2): 185–204 . doi : 10.1007/BF00178261 . PMID 8477186. S2CID 1324255 .  
  • Experimentos de triple resonancia para proteínas
  • Introducción a los experimentos de triple resonancia 3D
  • RMN de proteínas: una guía práctica