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Ureasa

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Las ureasas ( EC 3.5.1.5 ), funcionalmente, pertenecen a la superfamilia de amidohidrolasas y fosfotriesterasas. [ 2 ] Las ureasas se encuentran en numerosas bacterias , arqueas , hongos , algas , plantas y algunos invertebrados . Las ureasas son metaloenzimas de alto peso molecular que contienen níquel . [ 3 ] Las ureasas son importantes en la degradación de la materia fecal aviar, que es rica en ácido úrico, cuyo producto de degradación es la urea, la cual es degradada posteriormente por la ureasa como se describe aquí.

Estas enzimas catalizan la hidrólisis de la urea en dióxido de carbono y amoníaco :

(NH 2 ) 2 CO + H 2 O ureasa → CO 2 + 2NH 3

La hidrólisis de la urea se produce en dos etapas. En la primera, se generan amoníaco y ácido carbámico . El carbamato se hidroliza espontánea y rápidamente a amoníaco y ácido carbónico . La actividad de la ureasa aumenta el pH de su entorno, ya que se produce amoníaco, que es básico.

Historia

La actividad de la ureasa fue identificada por primera vez en 1876 por Frédéric Alphonse Musculus como un fermento soluble. [ 4 ] En 1926, James B. Sumner demostró que la ureasa es una proteína al examinar su forma cristalizada. [ 5 ] El trabajo de Sumner fue la primera demostración de que una proteína puede funcionar como una enzima y condujo finalmente al reconocimiento de que la mayoría de las enzimas son, de hecho, proteínas. La ureasa fue la primera enzima cristalizada. Por este trabajo, Sumner recibió el Premio Nobel de Química en 1946. [ 6 ] La estructura cristalina de la ureasa fue resuelta por primera vez por P.A. Karplus en 1995. [ 5 ]

Importancia

La ureasa es importante debido a su papel en el ciclo del nitrógeno como catalizador clave en la reacción que convierte la urea en amonio y CO₂ . La ureasa se encuentra como enzima del suelo , probablemente porque los microorganismos del suelo se benefician del nitrógeno que queda disponible por la degradación de la urea en forma de amonio. [ 7 ]

Estructura

Un estudio de 1984 centrado en la ureasa del frijol jack encontró que el sitio activo contiene un par de centros de níquel . [ 8 ] También se ha logrado la activación in vitro con manganeso y cobalto en lugar de níquel. [ 9 ] Las sales de plomo son inhibidoras .

El peso molecular es de 480 kDa o 545 kDa para la ureasa de la judía jack (masa calculada a partir de la secuencia de aminoácidos). 840 aminoácidos por molécula, de los cuales 90 son residuos de cisteína. [ 10 ]

El pH óptimo es 7,4 y la temperatura óptima es 60  °C. Los sustratos incluyen urea e hidroxiurea .

Las ureasas bacterianas están compuestas por tres subunidades distintas: una catalítica grande (α 60–76 kDa) y dos pequeñas (β 8–21 kDa, γ 6–14 kDa), que comúnmente forman trímeros (αβγ) 3 con una estequiometría y una estructura de simetría doble (nótese que la imagen superior muestra la estructura de la unidad asimétrica, un tercio del ensamblaje biológico real). Son enzimas ricas en cisteína, lo que resulta en masas molares enzimáticas entre 190 y 300 kDa. [ 10 ]

Se obtiene una ureasa excepcional de Helicobacter sp. Estas están compuestas por dos subunidades, α(26–31 kDa)-β(61–66 kDa). Estas subunidades forman un complejo supramolecular (αβ) 12 dodecamérico . [ 11 ] de subunidades α-β repetidas, cada par de subunidades acopladas tiene un sitio activo, para un total de 12 sitios activos. [ 11 ] Juega una función esencial para la supervivencia, neutralizando el ácido gástrico al permitir que la urea entre al periplasma a través de un canal de urea regulado por protones . [ 12 ] La presencia de ureasa se utiliza en el diagnóstico de especies de Helicobacter .

Todas las ureasas bacterianas son exclusivamente citoplasmáticas, excepto las de Helicobacter pylori , que, además de su actividad citoplasmática, presenta actividad externa con las células del huésped. En cambio, todas las ureasas vegetales son citoplasmáticas. [ 10 ]

Las ureasas de hongos y plantas están formadas por subunidades idénticas (~90 kDa cada una), que se ensamblan con mayor frecuencia como trímeros y hexámeros. Por ejemplo, la ureasa del frijol jack tiene dos subunidades estructurales y una catalítica. La subunidad α contiene el sitio activo y está compuesta por 840 aminoácidos por molécula (90 cisteínas), con una masa molecular de 90,77 kDa sin iones Ni(II). La masa del hexámero con los 12 iones de níquel es de 545,34 kDa. Otros ejemplos de estructuras homohexaméricas de ureasas vegetales son las enzimas de la soja, el guandú y las semillas de algodón. [ 10 ]

Aunque compuestas por diferentes tipos de subunidades, las ureasas de distintas fuentes, desde bacterias hasta plantas y hongos, presentan una alta homología en sus secuencias de aminoácidos. La cadena única de la ureasa vegetal es equivalente a una organización γ-β-α fusionada. La subunidad "α" de Helicobacter es equivalente a una fusión de las subunidades γ-β bacterianas normales, mientras que su subunidad "β" es equivalente a la subunidad α bacteriana normal. [ 10 ] Es probable que la organización de tres cadenas sea ancestral. [ 13 ]

Actividad

La kcat / Km de la ureasa en el procesamiento de la urea es 10¹⁴ veces mayor que la velocidad de la reacción de eliminación no catalizada de la urea . [ 5 ] Existen muchas razones para esta observación en la naturaleza. La proximidad de la urea a los grupos activos en el sitio activo, junto con la orientación correcta de la urea, permiten que la hidrólisis ocurra rápidamente. La urea por sí sola es muy estable debido a las formas de resonancia que puede adoptar. Se entiende que la estabilidad de la urea se debe a su energía de resonancia , que se ha estimado en 30–40 kcal/mol. [ 5 ] Esto se debe a que las formas de resonancia zwitteriónicas donan electrones al carbono carbonílico , lo que la hace menos electrófila y, por lo tanto, menos reactiva al ataque nucleofílico. [ 5 ]

Sitio activo

El sitio activo de las ureasas se encuentra en las subunidades α (alfa) . Es un centro de níquel dimérico bis-μ-hidroxo, con una distancia interatómica de ~3,5 Å. [ 5 ] > El par Ni(II) está débilmente acoplado antiferromagnéticamente . [ 14 ] Los estudios de espectroscopia de absorción de rayos X (XAS) de Canavalia ensiformis (frijol jack), Klebsiella aerogenes y Sporosarcina pasteurii (anteriormente conocida como Bacillus pasteurii ) [ 15 ] confirman iones de níquel de 5 a 6 coordenadas con ligación exclusivamente O/N, incluyendo dos ligandos de imidazol por níquel. [ 9 ] Se propone que el sustrato de urea desplace a los ligandos aquo .

Las moléculas de agua ubicadas hacia la abertura del sitio activo forman un cúmulo tetraédrico que llena la cavidad mediante enlaces de hidrógeno . Se propone que algunos residuos de aminoácidos forman una solapa móvil del sitio, que actúa como compuerta para el sustrato. [ 3 ] Los residuos de cisteína son comunes en la región de la solapa de las enzimas, y se ha determinado que no son esenciales para la catálisis, aunque participan en el posicionamiento adecuado de otros residuos clave en el sitio activo. [ 16 ] En la ureasa de Sporosarcina pasteurii , la solapa se encontró en conformación abierta, mientras que su conformación cerrada es aparentemente necesaria para la reacción. [ 15 ]

Al compararlas, las subunidades α de la ureasa de Helicobacter pylori y otras ureasas bacterianas se alinean con las ureasas del frijol jack. [ 16 ]

No se ha observado la unión de la urea al sitio activo de la ureasa. [ 10 ]

Mecanismos propuestos

Blakeley/Zerner

Blakely y Zerner propusieron un mecanismo para la catálisis de esta reacción por la ureasa. [ 17 ] Comienza con un ataque nucleofílico del oxígeno carbonílico de la molécula de urea sobre el Ni 5-coordinado (Ni-1). Un ligando de agua débilmente coordinado se desplaza en su lugar. Un par de electrones no enlazantes de uno de los átomos de nitrógeno de la molécula de urea crea un doble enlace con el carbono central, y el NH 2 − resultante del sustrato coordinado interactúa con un grupo cercano cargado positivamente. Blakely y Zerner propusieron que este grupo cercano fuera un ion carboxilato , aunque los carboxilatos desprotonados tienen carga negativa.

Un ligando hidróxido en el níquel hexacoordinado es desprotonado por una base. El carbono carbonílico es atacado posteriormente por el oxígeno electronegativo. Un par de electrones del doble enlace nitrógeno-carbono regresa al nitrógeno y neutraliza su carga, mientras que el carbono, ahora tetracoordinado, adopta una orientación tetraédrica intermedia.

La descomposición de este intermediario se ve favorecida por un grupo sulfhidrilo de una cisteína situada cerca del sitio activo. Un enlace de hidrógeno se une a uno de los átomos de nitrógeno, rompiendo su enlace con el carbono y liberando una molécula de NH₃ . Simultáneamente, se rompe el enlace entre el oxígeno y el níquel hexacoordinado. Esto deja un ion carbamato coordinado al níquel pentacoordinado, que posteriormente es desplazado por una molécula de agua, regenerando así la enzima.

El carbamato producido se degrada espontáneamente para producir amoníaco y ácido carbónico . [ 18 ]

Hausinger/Karplus

El mecanismo propuesto por Hausinger y Karplus intenta revisar algunos de los problemas evidentes en la vía de Blakely y Zerner, y se centra en las posiciones de las cadenas laterales que forman el bolsillo de unión de la urea. [ 5 ] A partir de las estructuras cristalinas de la ureasa de K. aerogenes , se argumentó que la base general utilizada en el mecanismo de Blakely, His 320 , estaba demasiado lejos del agua unida a Ni2 para desprotonarse y formar la porción de hidróxido atacante. Además, no se identificó el ligando ácido general necesario para protonar el nitrógeno de la urea. [ 19 ] Hausinger y Karplus sugieren un esquema de protonación inversa, donde una forma protonada del ligando His 320 desempeña el papel del ácido general y el agua unida a Ni2 ya está en estado desprotonado. [ 5 ] El mecanismo sigue la misma ruta, con la base general omitida (ya que no es necesaria) y His 320 donando su protón para formar la molécula de amoníaco, que luego se libera de la enzima. Si bien la mayoría de los ligandos de His 320 y el agua ligada no estarán en sus formas activas (protonadas y desprotonadas, respectivamente), se calculó que aproximadamente el 0,3% de la enzima ureasa total estaría activa en cualquier momento. [ 5 ] Si bien lógicamente, esto implicaría que la enzima no es muy eficiente, contrariamente al conocimiento establecido, el uso del esquema de protonación inversa proporciona una ventaja en una mayor reactividad para la forma activa, compensando la desventaja. [ 5 ] Colocar el ligando His 320 como un componente esencial en el mecanismo también toma en cuenta la región móvil de la solapa de la enzima. Como este ligando de histidina forma parte del segmento móvil, la unión del sustrato de urea para la catálisis cierra este segmento sobre el sitio activo y, junto con la adición del patrón de enlaces de hidrógeno a la urea proveniente de otros ligandos en el bolsillo, demuestra la selectividad de la enzima ureasa por la urea. [ 5 ]

Ciurli/Mangani

El mecanismo propuesto por Ciurli y Mangani [ 20 ] es una de las visiones más recientes y actualmente aceptadas del mecanismo de la ureasa y se basa principalmente en los diferentes roles de los dos iones de níquel en el sitio activo. [ 15 ] Uno de los cuales se une y activa la urea, el otro ion de níquel se une y activa la molécula de agua nucleofílica. [ 15 ] Con respecto a esta propuesta, la urea entra en la cavidad del sitio activo cuando la "solapa" móvil (que permite la entrada de la urea al sitio activo) está abierta. La estabilidad de la unión de la urea al sitio activo se logra a través de una red de enlaces de hidrógeno , orientando el sustrato hacia la cavidad catalítica. [ 15 ] La urea se une al níquel pentacoordinado (Ni1) con el átomo de oxígeno carbonílico . Se acerca al níquel hexacoordinado (Ni2) con uno de sus grupos amino y posteriormente une los dos centros de níquel. [ 15 ] La unión del átomo de oxígeno carbonílico de la urea a Ni1 se estabiliza a través del estado de protonación de His α222 Nԑ. Además, el cambio conformacional del estado abierto al cerrado del solapamiento móvil genera un reordenamiento del grupo carbonilo de Ala α222 de tal manera que su átomo de oxígeno apunta a Ni2. [ 15 ] Ala α170 y Ala α366 están ahora orientados de manera que sus grupos carbonilo actúan como aceptores de enlaces de hidrógeno hacia el grupo NH 2 de la urea, ayudando así a su unión a Ni2. [ 15 ] La urea es un ligando quelante muy débil debido al bajo carácter de base de Lewis de sus grupos NH 2. Sin embargo, los oxígenos carbonílicos de Ala α170 y Ala α366 aumentan la basicidad de los grupos NH 2 y permiten la unión a Ni2. [ 15 ] Por lo tanto, en este mecanismo propuesto, el posicionamiento de la urea en el sitio activo es inducido por las características estructurales de los residuos del sitio activo que están posicionados para actuar como donadores de enlaces de hidrógeno en las proximidades de Ni1 y como aceptores en las proximidades de Ni2. [ 15 ] La principal diferencia estructural entre el mecanismo de Ciurli/Mangani y los otros dos es que incorpora una urea puente de nitrógeno y oxígeno que es atacada por un hidróxido puente . [ 18 ]

Acción en la patogénesis

Las ureasas bacterianas suelen ser el mecanismo patogénico de muchas afecciones médicas. Se asocian con encefalopatía hepática / coma hepático , cálculos infecciosos y úlcera péptica. [ 21 ]

Cálculos infecciosos

Los cálculos urinarios inducidos por infección son una mezcla de estruvita (MgNH₄PO₄ • 6H₂O ) y apatita carbonatada [Ca₁₀ ( PO₄ ) ₆•CO₃ ] . [ 21 ] Estos iones polivalentes son solubles, pero se vuelven insolubles cuando se produce amoníaco a partir de la ureasa microbiana durante la hidrólisis de la urea , ya que esto aumenta el pH del entorno circundante de aproximadamente 6,5 a 9. [ 21 ] La alcalinización resultante produce la cristalización del cálculo . [ 21 ] En humanos, la ureasa microbiana, Proteus mirabilis , es la más común en los cálculos urinarios inducidos por infección. [ 22 ]

Ureasa en la encefalopatía hepática / coma hepático

Estudios han demostrado que Helicobacter pylori, junto con la cirrosis hepática, causa encefalopatía hepática y coma hepático . [ 23 ] Helicobacter pylori libera ureasas microbianas en el estómago. La ureasa hidroliza la urea para producir amoníaco y ácido carbónico . Dado que las bacterias se localizan en el estómago, el amoníaco producido es absorbido fácilmente por el sistema circulatorio desde la luz gástrica . [ 23 ] Esto resulta en niveles elevados de amoníaco en la sangre, una condición conocida como hiperamonemia ; la erradicación de Helicobacter pylori muestra disminuciones marcadas en los niveles de amoníaco . [ 23 ]

Ureasa en úlceras pépticas

Helicobacter pylori también es la causa de úlceras pépticas, manifestándose en el 55-68% de los casos reportados. [ 24 ] Esto se confirmó por la disminución del sangrado de la úlcera y la recurrencia de la úlcera después de la erradicación del patógeno . [ 24 ] En el estómago hay un aumento en el pH del revestimiento mucoso como resultado de la hidrólisis de la urea , lo que impide el movimiento de iones de hidrógeno entre las glándulas gástricas y la luz gástrica . [ 21 ] Además, las altas concentraciones de amoníaco tienen un efecto en las uniones estrechas intercelulares aumentando la permeabilidad y también alterando la membrana mucosa gástrica del estómago. [ 21 ] [ 25 ]

Ocurrencia y aplicaciones en la agricultura

La urea se encuentra de forma natural en el medio ambiente y también se introduce artificialmente, constituyendo más de la mitad de todos los fertilizantes nitrogenados sintéticos utilizados a nivel mundial. [ 26 ] Se cree que el uso intensivo de urea promueve la eutrofización , a pesar de que se ha observado que la urea se transforma rápidamente por las ureasas microbianas y, por lo tanto, generalmente no persiste. [ 27 ] La actividad de la ureasa ambiental se mide a menudo como un indicador de la salud de las comunidades microbianas. En ausencia de plantas, la actividad de la ureasa en el suelo generalmente se atribuye a microorganismos heterótrofos, aunque se ha demostrado que algunas bacterias quimioautótrofas oxidantes de amonio son capaces de crecer utilizando urea como única fuente de carbono, nitrógeno y energía. [ 28 ]

Inhibición en fertilizantes

La inhibición de la ureasa es un objetivo importante en la agricultura porque la rápida degradación de los fertilizantes a base de urea es un derroche y un daño ambiental. [ 29 ] El fenil fosforodiamidato y la N -( n -butil)tiofosfórica triamida son dos de estos inhibidores. [ 30 ]

Biomineralización

Al promover la formación de carbonato de calcio , las ureasas son potencialmente útiles para procesos inspirados en la biomineralización . [ 31 ] Cabe destacar que la formación de carbonato de calcio inducida microbiológicamente puede utilizarse en la fabricación de bioconcreto . [ 32 ]

Acción no enzimática

Además de actuar como enzima, algunas ureasas (especialmente las vegetales) tienen efectos adicionales que persisten incluso cuando se desactiva su función catalítica. Estos incluyen entomotoxicidad, inhibición de hongos, neurotoxicidad en mamíferos, promoción de la endocitosis y la producción de eicosanoides inflamatorios en mamíferos, e inducción de quimiotaxis en bacterias. Estas actividades podrían formar parte de un mecanismo de defensa. [ 13 ]

La toxicidad de la ureasa para los insectos se observó originalmente en la canatoxina, una isoforma ortóloga de la ureasa del frijol jack. La digestión del péptido identificó una porción de 10 kDa, la principal responsable de este efecto, denominada jaburetox. Una porción análoga de la ureasa de la soja se denomina soyuretox. Sin embargo, estudios en insectos demuestran que la proteína completa es tóxica sin necesidad de digestión. No obstante, los péptidos "uretox", al tener una mayor concentración de toxicidad, se muestran prometedores como biopesticidas . [ 13 ]

Como prueba diagnóstica

Muchos patógenos del tracto gastrointestinal o urinario producen ureasa, lo que permite utilizar la detección de ureasa como método de diagnóstico para detectar la presencia de patógenos.

Entre los patógenos ureasa-positivos se incluyen:

Ligandos

inhibidores

Se conoce una amplia gama de inhibidores de la ureasa de diferentes familias estructurales. La inhibición de la ureasa no solo es de interés para la agricultura, sino también para la medicina, ya que patógenos como H. pylori producen ureasa como mecanismo de supervivencia. Las clases estructurales conocidas de inhibidores incluyen: [ 34 ] [ 35 ]

  • Análogos de la urea, siendo los más fuertes las tioureas como la 1-(4-clorofenil)-3-palmitoiltiourea.
  • Los fosforamidatos son los más utilizados en la agricultura (véase más arriba).
  • Hidroquinona y quinonas. En medicina, las más interesantes son las quinolonas , una clase de antibióticos ya ampliamente utilizados.
  • Algunos metabolitos vegetales también son inhibidores de la ureasa, como por ejemplo la alicina . Estos tienen potencial tanto como aditivos para fertilizantes respetuosos con el medio ambiente [ 36 ] como fármacos naturales.

Extracción

Fue aislada por primera vez como cristal en 1926 por Sumner, utilizando solvatación con acetona y centrifugación. [ 37 ] La bioquímica moderna ha aumentado su demanda de ureasa. La harina de frijol jack , [ 38 ] las semillas de sandía , [ 39 ] y las semillas de guisante [ 40 ] han demostrado ser fuentes útiles de ureasa.

Véase también

Referencias

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