Detección de SNV a partir de datos NGS

En un mundo ideal sin errores y con alta cobertura de lectura , la tarea de identificar variantes a partir de los resultados de una alineación de datos NGS sería sencilla; en cada locus (posición en el genoma) se puede contar el número de ocurrencias de cada nucleótido distinto entre las lecturas alineadas en esa posición, y el genotipo verdadero sería obvio: AA si todos los nucleótidos coinciden con el alelo A , BB si coinciden con el alelo B , o AB si hay una mezcla. Sin embargo, al trabajar con datos NGS reales, este enfoque ingenuo no se utiliza, ya que no puede tener en cuenta el ruido en los datos de entrada. ^{[ 4 ]} Los recuentos de nucleótidos utilizados para la identificación de bases contienen errores y sesgos, debidos tanto a las lecturas secuenciadas como al proceso de alineación. Este problema puede mitigarse hasta cierto punto mediante la secuenciación a una mayor profundidad de cobertura de lectura; sin embargo, esto suele ser costoso, y muchos estudios prácticos requieren realizar inferencias sobre datos de baja cobertura. ^{[ 1 ]}

Los métodos probabilísticos buscan superar el problema mencionado, generando estimaciones robustas de las probabilidades de cada uno de los genotipos posibles, teniendo en cuenta el ruido y otra información previa disponible que puede utilizarse para mejorar las estimaciones. Posteriormente, se puede predecir un genotipo basándose en estas probabilidades, a menudo según la estimación MAP .

Los métodos probabilísticos para la detección de variantes se basan en el teorema de Bayes . En el contexto de la detección de variantes, el teorema de Bayes define la probabilidad de que cada genotipo sea el verdadero, dados los datos observados, en términos de las probabilidades a priori de cada genotipo posible y la distribución de probabilidad de los datos dado cada genotipo posible. La fórmula es:

${\displaystyle {\begin{aligned}P(G\mid D)&={\frac {P(D\mid G)P(G)}{P(D)}}\\[8pt]&={\frac {P(D\mid G)\,P(G)}{\sum \limits _{i=1}^{n}P(D\mid G_{i})\,P(G_{i})}}\end{aligned}}}$

En la ecuación anterior:

• ${\displaystyle D}$se refiere a los datos observados; es decir, las lecturas alineadas
• ${\displaystyle G}$es el genotipo cuya probabilidad se está calculando
• ${\displaystyle G_{i}}$se refiere al i -ésimo genotipo posible, de entre n posibilidades.

Dado el marco anterior, las diferentes soluciones de software para detectar SNV varían en función de cómo calculan las probabilidades previas.${\displaystyle P(G)}$, el modelo de error utilizado para modelar las probabilidades${\displaystyle P(D\mid G)}$y la partición de los genotipos generales en subgenotipos separados, cuyas probabilidades pueden estimarse individualmente en este marco. ^{[ 5 ]}

Como alternativa a los métodos probabilísticos, existen métodos heurísticos para la detección de variantes en datos de secuenciación de nueva generación (NGS). En lugar de modelar la distribución de los datos observados y utilizar la estadística bayesiana para calcular las probabilidades de genotipo, la detección de variantes se basa en diversos factores heurísticos, como recuentos mínimos de alelos, umbrales de calidad de lectura, límites de profundidad de lectura, etc. Si bien han sido relativamente impopulares en la práctica en comparación con los métodos probabilísticos, gracias al uso de límites y umbrales, pueden ser robustos ante datos atípicos que violan los supuestos de los modelos probabilísticos. ^{[ 9 ]}

Una parte importante del diseño de métodos de detección de variantes mediante datos NGS es la secuencia de ADN utilizada como referencia para alinear las lecturas NGS. En estudios de genética humana, se dispone de referencias de alta calidad, procedentes de fuentes como el proyecto HapMap ^{[ 10 ]} , que pueden mejorar sustancialmente la precisión de las llamadas de variantes realizadas por los algoritmos de detección de variantes. Además, dichas referencias pueden proporcionar probabilidades de genotipo previas para análisis bayesianos. Sin embargo, en ausencia de una referencia de tan alta calidad, las lecturas obtenidas experimentalmente pueden ensamblarse primero para crear una secuencia de referencia para la alineación ^{[ 1 ] .}

Existen diversos métodos para filtrar datos en experimentos de detección de variantes, con el fin de eliminar fuentes de error o sesgo. Esto puede implicar la eliminación de lecturas sospechosas antes de realizar la alineación y/o el filtrado de la lista de variantes devuelta por el algoritmo de detección de variantes.

Dependiendo de la plataforma de secuenciación utilizada, pueden existir diversos sesgos en el conjunto de lecturas secuenciadas. Por ejemplo, puede producirse un sesgo de hebra, donde existe una distribución muy desigual de las direcciones directa e inversa en las lecturas alineadas en una región cercana. Además, puede producirse una duplicación inusualmente alta de algunas lecturas (por ejemplo, debido a un sesgo en la PCR ). Dichos sesgos pueden dar lugar a llamadas de variantes dudosas; por ejemplo, si un fragmento que contiene un error de PCR en algún locus se sobreamplifica debido a un sesgo de PCR, ese locus tendrá un alto recuento del alelo falso y puede ser clasificado como un SNV. Por ello, los flujos de trabajo de análisis suelen filtrar las llamadas en función de estos sesgos. ^{[ 1 ]}

Hasta hace poco, las herramientas de software para realizar este tipo de análisis estaban muy poco desarrolladas y se basaban en los mismos algoritmos utilizados para detectar variaciones en la línea germinal. Dichos procedimientos no están optimizados para esta tarea, ya que no modelan adecuadamente la correlación estadística entre los genotipos presentes en múltiples muestras de tejido del mismo individuo. ^{[ 3 ]}

Investigaciones más recientes han dado como resultado el desarrollo de herramientas de software especialmente optimizadas para la detección de mutaciones somáticas a partir de múltiples muestras de tejido. Se han desarrollado técnicas probabilísticas que combinan los recuentos de alelos de todas las muestras de tejido en cada locus y, utilizando modelos estadísticos para las probabilidades de genotipos conjuntos para todos los tejidos y la distribución de los recuentos de alelos dado el genotipo, son capaces de calcular probabilidades relativamente robustas de mutaciones somáticas en cada locus utilizando todos los datos disponibles. ^{[ 3 ] [ 12 ]} Además, recientemente se ha investigado el uso de técnicas basadas en aprendizaje automático para realizar este análisis. ^{[ 13 ] [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ]}

En 2021, el Consorcio de Control de Calidad de Secuenciación Fase 2 ^{[ 17 ]} publicó varios estudios que investigaron los efectos de las preparaciones de muestras, los kits de bibliotecas de secuenciación, las plataformas de secuenciación y los flujos de trabajo bioinformáticos en la precisión de la detección de SNV somáticos ^{[ 18 ]} basándose en un par de líneas celulares tumorales-normales que el Consorcio ha establecido como muestras de referencia, datos y conjuntos de llamadas. ^{[ 19 ]}