Hispanopedia WikiLa inactivación viral es el proceso de hacer que un virus sea incapaz de causar infección. Desempeña un papel fundamental en múltiples campos, como la medicina clínica, el diagnóstico, la investigación y la industria alimentaria.
En la práctica clínica, la inactivación es esencial para prevenir la transmisión viral a través de productos sanguíneos [ 1 ] —como transfusiones y otros materiales biológicos—, así como en la fabricación de productos biofarmacéuticos . En contextos de diagnóstico e investigación, la inactivación permite el estudio y la manipulación seguros de virus sin riesgo de transmisión al personal de laboratorio o sanitario. Además, en el desarrollo de vacunas, se emplean virus inactivados para estimular el sistema inmunitario del huésped , promoviendo la producción de anticuerpos neutralizantes [ 2 ] .
Existe una amplia gama de técnicas de inactivación viral, desde la eliminación física por filtración hasta métodos mecánicos y químicos. La elección de la técnica depende del contexto específico y del propósito previsto. En muchas situaciones, se emplea una combinación de métodos, especialmente al manipular virus altamente patógenos, donde la esterilidad absoluta es fundamental.
Algunos de los virus más comunes eliminados por estos métodos son los virus VIH-1 y VIH-2 ; los virus de la hepatitis A, B y C; y los parvovirus . [ 3 ]
Eliminación
Este proceso general, conocido simplemente como eliminación de virus, consiste en la eliminación de todos los virus presentes en una muestra determinada mediante métodos de extracción tradicionales o de [alta energía]. Algunos de los métodos más destacados incluyen:
Estos procesos de extracción se consideran "procesos tradicionales" porque no afectan químicamente al virus de ninguna manera; simplemente lo eliminan físicamente de la muestra.
Nanofiltración
Los procesos de eliminación de virus mediante técnicas de nanofiltración [ 4 ] eliminan los virus específicamente por exclusión de tamaño. Este tipo de proceso se utiliza típicamente para parvovirus [ 5 ] y otros virus que contienen una cubierta proteica . Un virión típico del VIH mide 180 nm y un parvovirus típico puede variar entre 15 y 24 nm, lo cual es muy pequeño. Una gran ventaja de la filtración, en comparación con los métodos que implican temperaturas o acidez extremas, es que no desnaturaliza las proteínas de la muestra. La nanofiltración también es eficaz para la mayoría de los tipos de proteínas. Dado que no es químicamente selectiva, independientemente de la química superficial de la partícula viral, los procesos de eliminación de virus mediante técnicas de nanofiltración seguirán siendo eficaces. Otra gran ventaja de esta técnica es su capacidad para realizarse a escala de laboratorio y luego escalarse eficazmente a estándares de producción. Sin embargo, es importante considerar que el nivel de eliminación de los virus depende del tamaño de los poros del nanofiltro. En algunos casos, los virus muy pequeños no se filtrarán. También es necesario considerar los posibles efectos de la variación de la presión y del caudal.
Algunos de los filtros utilizados para realizar este tipo de procesos son Planova 15N, [ 6 ] Planova 20N, BioEX, VAG - 300, Viresolve 180, [ 7 ] Viresolve 70TM y la gama Virosart [ 8 ] .
Cromatografía
Los métodos cromatográficos para eliminar virus son excelentes para purificar la proteína y también son eficaces contra todo tipo de virus, pero el grado de eliminación depende de la composición de la columna y de los reactivos utilizados. La eficacia de este proceso puede variar considerablemente entre virus y su eficiencia puede cambiar según el tampón empleado. La higiene entre lotes también es un aspecto importante a considerar al realizar este procedimiento.
La cromatografía de membrana es cada vez más popular para la purificación y eliminación de virus.
Inactivación
El estudio y la manipulación de virus, independientemente de la aplicación, a menudo requieren un paso previo de inactivación. El objetivo es lograr que el virus sea seguro y no infeccioso, conservando al mismo tiempo la integridad estructural suficiente para permitir un análisis significativo. [ 2 ]
Para los estudios serológicos, la preservación de los epítopos de superficie es fundamental, ya que estas estructuras virales sobresalientes median la unión de anticuerpos. La antigenicidad es particularmente importante en el desarrollo de vacunas, donde la eficacia depende de la inducción de una respuesta inmune significativa del huésped, especialmente la producción de anticuerpos neutralizantes. [ 2 ]
En cambio, para los estudios moleculares se prioriza la preservación del material genético viral, como el ARN o el ADN, en lugar de las estructuras superficiales. Este requisito es fundamental para muchos métodos de diagnóstico microbiológico, incluyendo la PCR, otras técnicas de amplificación y la secuenciación.
La inactivación de virus puede lograrse mediante métodos físicos o químicos, y a menudo se emplea una combinación de ambos. Esto es especialmente necesario cuando se trabaja con virus altamente patógenos, donde la esterilidad completa es esencial para eliminar el riesgo de exposición. [ 2 ]
Los métodos de inactivación física incluyen calor (pasteurización), luz ultravioleta (UV), radiación gamma e inactivación por alteración del pH. Los enfoques químicos abarcan sales caotrópicas a base de guanidinio, detergentes (p. ej., dodecilsulfato de sodio [SDS], metanol , compuestos Tween, Triton X-100), β-propiolactona, peróxido de hidrógeno y aldehídos (p. ej., formaldehído , paraformaldehído, glutaraldehído ), así como disulfuros aromáticos. [ 2 ] Además, los compuestos fotoactivos forman una clase distinta de agentes químicos que requieren inducción lumínica, como los psoralenos, la azida de 1,5-iodonaftilo , el azul de metileno y la riboflavina. [ 2 ]
Inactivación por solvente/detergente (S/D)
Este proceso, desarrollado por el Centro de Sangre de Nueva York , [ 9 ] es el método de inactivación viral más utilizado hasta la fecha. Se utiliza principalmente en la industria del plasma sanguíneo , por más de 50 organizaciones en todo el mundo y por la Cruz Roja Americana . Sin embargo, este proceso solo es efectivo para virus envueltos en una capa lipídica . Los detergentes utilizados en este método interrumpen las interacciones entre las moléculas de la capa lipídica del virus. La mayoría de los virus envueltos no pueden existir sin su capa lipídica, por lo que se destruyen al exponerse a estos detergentes. Otros virus pueden no destruirse, pero son incapaces de reproducirse, lo que los vuelve no infecciosos. El solvente crea un entorno en el que la reacción de agregación entre la capa lipídica y el detergente ocurre más rápidamente. El detergente que se usa típicamente es Triton X-100 .
Este proceso presenta muchas de las ventajas de las técnicas de eliminación tradicionales. No desnaturaliza las proteínas, ya que los detergentes solo afectan a los lípidos y sus derivados. Se logra una eliminación viral del 100% y el equipo es relativamente sencillo y fácil de usar. Sería necesario contar con equipos diseñados para purificar el material inactivado tras la eliminación del virus, a fin de evitar la contaminación de los flujos de proceso posteriores.
El tratamiento S/D utiliza reactivos fácilmente disponibles y relativamente económicos, pero estos deben eliminarse del producto antes de su distribución, lo que requiere pasos adicionales en el proceso. Dado que este proceso elimina o inactiva la envoltura lipídica del virus, los virus que carecen de ella no se verán afectados. Además, los tampones utilizados en este proceso no producen ningún efecto de inactivación.
Pasteurización
La inactivación de virus mediante pasteurización puede ser muy eficaz si las proteínas que se intentan proteger son más resistentes al calor que las impurezas virales presentes en la solución. Algunas de las ventajas más destacadas de este tipo de procesos son que requieren equipos sencillos y son eficaces tanto para virus con envoltura como sin ella. Dado que la pasteurización implica elevar la temperatura de la solución a un valor que desnaturaliza el virus lo suficiente, no importa si el virus tiene envoltura o no, ya que la envoltura por sí sola no puede protegerlo de temperaturas tan elevadas. Sin embargo, se ha descubierto que algunas proteínas actúan como estabilizadores térmicos de los virus. Por supuesto, si la proteína objetivo no es resistente al calor, el uso de esta técnica podría desnaturalizar tanto dicha proteína como la impureza viral. La incubación típica dura 10 horas y se realiza a 60 °C.
Inactivación por pH ácido
Algunos virus, al exponerse a un pH bajo , se desnaturalizan espontáneamente. Al igual que la pasteurización, esta técnica de inactivación viral resulta útil si la proteína objetivo es más resistente a pH bajos que la impureza viral. Esta técnica es eficaz contra virus con envoltura, y el equipo que se suele utilizar es sencillo y fácil de manejar. Sin embargo, este método de inactivación no es tan eficaz contra virus sin envoltura y, además, requiere temperaturas elevadas. Por lo tanto, para utilizar este método, la proteína objetivo debe ser resistente a pH bajos y altas temperaturas, lo cual, lamentablemente, no ocurre con muchas proteínas biológicas. La incubación para este proceso suele realizarse a un pH de 4 y dura entre 6 horas y 21 días.
La inactivación ácida se utiliza comúnmente en el proceso de fabricación de biofármacos basados en anticuerpos monoclonales . El proceso consiste en reducir el pH a un valor cercano o inferior a 3,6 e incubar durante al menos treinta minutos a temperatura ambiente. [ 10 ]
inactivación por luz ultravioleta (UV)
Los rayos UV pueden dañar el ADN de los organismos vivos al crear dímeros de ácidos nucleicos . Sin embargo, estos daños suelen ser leves debido a la baja penetración de los rayos UV en los tejidos vivos. No obstante, los rayos UV pueden utilizarse para inactivar virus, ya que las partículas virales son pequeñas y los rayos UV pueden alcanzar el material genético, induciendo la dimerización de los ácidos nucleicos. Una vez que el ADN se ha dimerizado, las partículas virales no pueden replicar su material genético, lo que impide su propagación.
Se ha demostrado que la luz UV en combinación con riboflavina es eficaz para reducir los patógenos en los productos de transfusión sanguínea . [ 11 ] [ 12 ] La riboflavina y la luz UV dañan los ácidos nucleicos de virus, bacterias, parásitos y glóbulos blancos del donante, impidiendo que se repliquen y causen enfermedades. [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ]
Estudios de adición
En muchos casos, la concentración de virus en una muestra determinada es extremadamente baja. En otros procesos de extracción, los bajos niveles de impurezas pueden ser insignificantes, pero dado que los virus son impurezas infecciosas , incluso una sola partícula viral puede ser suficiente para arruinar toda una cadena de procesos. Por esta razón, se deben tomar medidas especiales para determinar el método de eliminación o inactivación adecuado para cada tipo de virus que se extraiga de cualquier tipo de solución.
Los estudios de adición de virus se crearon específicamente para este propósito. Un estudio de este tipo se realiza para determinar los posibles métodos de eliminación o inactivación viral. Los resultados de estos estudios son numéricos y, basándose en estos datos, los investigadores pueden determinar si el proceso empleado es adecuado para los virus que intentan extraer y la solución de la que pretenden obtenerlos.
El método
Se ha demostrado experimentalmente que aumentar la carga viral (o nivel de actividad) de una muestra en un factor de 10⁴ o 10⁵ con respecto a la original solo modifica las tasas de eliminación/inactivación del virus en un orden de magnitud . A partir de este conocimiento, se han desarrollado estudios de adición viral en los que se incrementa la carga viral (o nivel de activación) en un factor de 10⁴ o 10⁵ con respecto a la muestra original. Esta nueva carga viral, o nivel de actividad, se procesa y purifica. La carga viral o el nivel de actividad se registran al inicio y al final del proceso y se utilizan para calcular el factor de reducción.
Factor de reducción
El factor de reducción (FR) para un paso de eliminación o inactivación de virus se calcula utilizando la siguiente ecuación: [ 16 ]
Paso de RF = log 10 [(V1 x T1)/(V2 x T2)]
Donde: V1 = volumen de materia prima contaminada antes del paso de limpieza; T1 = concentración de virus de la materia prima contaminada antes del paso de limpieza; V2 = volumen de material después del paso de limpieza; y T2 = concentración de virus del material después del paso de limpieza.
El factor de reducción necesario para una determinada corriente de proceso depende de muchos factores diferentes, algunos de los cuales incluyen:
- La concentración inicial esperada del virus
- El producto que se está purificando
- La dosis infecciosa del virus (para uso in vivo )
- Si la inactivación es una alternativa viable a la eliminación completa
- Las capacidades del laboratorio
- La dificultad relativa del método de inactivación o eliminación
Aplicaciones
Esta tecnología se ha utilizado ampliamente en las industrias alimentaria y farmacéutica, pero también se han encontrado otras aplicaciones del procesamiento viral:
- Purificación del aire (Millipore) [ 17 ]
- Vacunas
- Análisis serológico
- Análisis molecular
- Extracción de muestras virales
- purificación del agua
- Inactivación del virus del Nilo Occidental
Referencias
- ↑ Shander A, Lobel GP, Javidroozi M (junio de 2016). "Prácticas de transfusión y riesgos infecciosos". Expert Review of Hematology . 9 (6): 597– 605. doi : 10.1586/17474086.2016.1164593 . PMID 26959944. S2CID 36732554 .
- 1 2 3 4 5 6 Elveborg S, Monteil V, Mirazimi A (2022-02-19). "Métodos de inactivación de virus altamente patógenos para fines moleculares, serológicos o de desarrollo de vacunas" . Pathogens . 11 ( 2): 271. doi : 10.3390/pathogens11020271 . ISSN 2076-0817 . PMC 8879476. PMID 35215213 .
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- ↑ Goodrich RP, et al., Capítulo 5: "Propiedades antivirales y antibacterianas de la riboflavina y la luz: aplicaciones a la seguridad sanguínea y la medicina transfusional". Flavinas: Fotoquímica y fotobiología, vol. 6, 2006, Royal Society of Chemistry; Cambridge, Reino Unido. Editores: E Silva y AM Edwards.
- ↑ Kumar V, et al., "Reducción de patógenos basada en riboflavina y luz ultravioleta: alcance y consecuencias del daño al ADN a nivel molecular." Fotoquímica y fotobiología 2004; 80: 15-21.
- ↑ Goodrich, RP, et al, "Definición del rendimiento 'adecuado' en la reducción de patógenos para componentes sanguíneos transfundidos". Aceptado para su publicación en Transfusion 2010.
- ↑ Nota orientativa sobre estudios de validación de virus: Diseño, contribución e interpretación de estudios que validan la inactivación y eliminación de virus, EMEA CPMP BWP, 268/95 1996
- ↑ "Optimización del rendimiento del filtro de virus con prefiltración" . Millipore . Consultado el 23 de noviembre de 2010 .
- Virología
