Western blot normalization

Cuando se utilizan anticuerpos fluorescentes para visualizar proteínas en Western blots, la normalización requiere que el usuario defina los límites superior e inferior de cuantificación y caracterice la relación lineal entre la intensidad de la señal y el volumen de masa de la muestra para cada antígeno . ^{[ 1 ]} Tanto la proteína diana como el control de normalización deben fluorescer dentro del rango dinámico de detección. ^{[ 1 ]} Muchos HKP se expresan en niveles altos y se prefieren para su uso con proteínas diana altamente expresadas. ^{[ 1 ]} Las proteínas de menor expresión son difíciles de detectar en el mismo blot. ^{[ 1 ]}

Los anticuerpos fluorescentes están disponibles comercialmente, y se recomienda el uso de anticuerpos completamente caracterizados para garantizar la consistencia de los resultados. ^{[ 11 ] [ 12 ] [ 13 ]}

Cuando no se utiliza la detección por fluorescencia, la proteína de control de carga y la proteína de interés deben diferir considerablemente en peso molecular para que se separen adecuadamente mediante electroforesis en gel para un análisis preciso. ^{[ 1 ]}

Cuando se detectan múltiples proteínas diana en la misma membrana, es necesario decaparla y volver a sondearla con un nuevo conjunto de anticuerpos de detección. ^{[ 6 ]} Un decapado ineficaz podría resultar en una señal débil de la proteína diana. ^{[ 6 ]} Para evitar la pérdida del antígeno, se recomiendan solo tres incubaciones de decapado por membrana. ^{[ 6 ]} Puede ser difícil eliminar por completo la señal de proteínas muy abundantes, por lo que se recomienda detectar primero las proteínas de baja expresión. ^{[ 6 ]}

Dado que los niveles de HKP pueden ser inconsistentes entre tejidos, los científicos pueden controlar la proteína de interés agregando una proteína exógena pura de concentración conocida dentro del rango lineal del anticuerpo. ^{[ 8 ] [ 9 ] [ 10 ]} En comparación con HKP, hay una mayor variedad de proteínas disponibles para controles de inserción. ^{[ 14 ]}

Los colorantes aniónicos como Ponceau S y azul brillante de Coomassie , y los colorantes fluorescentes como Sypro Ruby y Deep Purple, se utilizan antes de agregar los anticuerpos porque no afectan la inmunodetección posterior. ^{[ 17 ] [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ]}

Ponceau S es un colorante reversible con carga negativa que tiñe las proteínas de un color rosa rojizo y se elimina fácilmente lavando con agua. ^{[ 21 ] [ 22 ]} La intensidad de la tinción con Ponceau S disminuye rápidamente con el tiempo, por lo que la documentación debe realizarse con rapidez. ^{[ 5 ]} Se ha informado de un rango lineal de hasta 140  μg para Ponceau S con baja reproducibilidad debido a su intensidad de tinción altamente dependiente del tiempo y baja relación señal-ruido . ^{[ 21 ] [ 22 ]}

Los colorantes fluorescentes como Sypro Ruby tienen un amplio rango lineal y son más sensibles que los colorantes aniónicos. ^{[ 22 ]} Son colorantes permanentes y fotoestables que se pueden visualizar con un transiluminador UV o de luz azul estándar o con un escáner láser. ^{[ 1 ] [ 22 ]} Las membranas se pueden documentar en película o digitalmente utilizando una cámara de dispositivo de carga acoplada . ^{[ 23 ]} La tinción de transferencia con Sypro Ruby requiere mucho tiempo y tiende a saturarse por encima de 50 μg de proteína por carril. ^{[ 22 ]}

El negro amido es una tinción aniónica post-anticuerpo permanente de uso común que es más sensible que el Ponceau S. ^{[ 24 ]} Esta tinción se aplica después de la inmunodetección. ^{[ 24 ]}

La tecnología sin tinción emplea una química en gel para la obtención de imágenes. ^{[ 22 ] [ 25 ] [ 26 ]} Esta reacción química no afecta la transferencia de proteínas ni la unión de anticuerpos posteriores. ^{[ 27 ]} Además, no implica pasos de tinción/decoloración, y la intensidad de las bandas permanece constante en el tiempo. ^{[ 28 ]}

La tecnología sin tinción no puede detectar proteínas que no contengan residuos de triptófano . Se necesita un mínimo de dos triptófanos para permitir la detección. ^{[ 5 ]} El rango lineal para la normalización sin tinción es de hasta 80  μg de proteína por carril para geles de 18 pocillos y hasta 100  μg por carril para geles Criterion de tamaño medio de 12 pocillos. Este rango es compatible con las cargas de proteína típicas en los Western blots cuantitativos y permite cálculos de control de carga en un amplio rango de carga de proteína. ^{[ 29 ] [ 4 ]} Recientemente también se ha puesto a disposición un método sin tinción más eficiente. ^{[ 30 ] [ 31 ]} Cuando se utilizan altas cargas de proteína, la tecnología sin tinción ha demostrado mayor éxito que las tinciones. ^{[ 29 ]}