Microscopía multifotónica de campo amplio

La microscopía multifotónica de campo amplio ^{[ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ]} se refiere a una técnica de imagen óptica no lineal diseñada para imágenes ultrarrápidas en la que se ilumina y se obtiene la imagen de una gran área del objeto sin necesidad de escaneo. Se requieren altas intensidades para inducir procesos ópticos no lineales como la fluorescencia de dos fotones o la generación de segundo armónico . En los microscopios multifotónicos de escaneo, las altas intensidades se logran enfocando la luz con precisión, y la imagen se obtiene mediante el escaneo del haz. En la microscopía multifotónica de campo amplio, las altas intensidades se logran mejor utilizando una fuente láser pulsada ópticamente amplificada para obtener un gran campo de visión (~100  μm). ^{[ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]} En este caso, la imagen se obtiene como un solo fotograma con un CCD sin necesidad de escaneo, lo que hace que la técnica sea particularmente útil para visualizar procesos dinámicos simultáneamente en todo el objeto de interés. Con la microscopía multifotónica de campo amplio, la velocidad de fotogramas puede incrementarse hasta 1000 veces en comparación con la microscopía de escaneo multifotónica . ^{[ 3 ]} Los microscopios multifotónicos de campo amplio aún no están disponibles comercialmente, pero existen prototipos funcionales en varios laboratorios de óptica.

La característica principal de la técnica es la iluminación de una amplia área de la muestra con un haz láser pulsado. En óptica no lineal, la cantidad de fotones no lineales (N) generados por un haz pulsado por área (de iluminación) por segundo es proporcional a ^{[ 6 ] [ 7 ].}

${\displaystyle N\varpropto {\frac {E^{2}}{\tau A}}f}$,

donde E es la energía del haz en julios, τ es la duración del pulso en segundos, A es el área de iluminación en metros cuadrados y f es la frecuencia de repetición del haz pulsado en hercios. Aumentar el área de iluminación reduce la cantidad de fotones no lineales generados a menos que se aumente la energía. El daño óptico depende de la densidad de energía, es decir, intensidad máxima por área I _p =E/(τA). Por lo tanto, tanto el área como la energía se pueden aumentar fácilmente sin riesgo de daño óptico si la intensidad máxima por área se mantiene baja, y aun así se puede obtener una ganancia en la cantidad de fotones no lineales generados debido a la dependencia cuadrática. Por ejemplo, aumentar tanto el área como la energía 1000 veces, deja la intensidad máxima sin cambios, pero aumenta los fotones no lineales generados en 1000 veces. Estos 1000 fotones adicionales se generan efectivamente en un área mayor. En la obtención de imágenes, esto significa que los 1000 fotones adicionales se distribuyen por la imagen, lo que en un principio podría no parecer una ventaja sobre la microscopía de escaneo multifotónico. Sin embargo, la ventaja se hace evidente cuando se consideran el tamaño de la imagen y el tiempo de escaneo. ^{[ 3 ]} La cantidad de fotones no lineales por fotograma de imagen por segundo generados por un microscopio multifotónico de campo amplio en comparación con un microscopio multifotónico de escaneo viene dada por ^{[ 3 ]}

${\displaystyle {\frac {N_{\mathrm {campo amplio} }}{N_{\mathrm {escaneo} }}}=n{\frac {f_{\mathrm {campo amplio} }}{f_{\mathrm {escaneo} }}}}$,

cuando se supone que se utiliza la misma intensidad máxima en ambos sistemas. Aquí n es el número de puntos de escaneo tales que${\textstyle A_{\mathrm {campo amplio} }=nA_{\mathrm {escaneo} }}$.

There is the technical difficulty of achieving a large illumination area without destroying the imaging optics. One approach is the so-called spatiotemporal focusing^[4][5] in which the pulsed beam is spatially dispersed by a diffraction grating forming a 'rainbow' beam that is subsequently focused by an objective lens.^[5] The effect of focusing the 'rainbow' beam while imaging the diffraction grating forces the different wavelengths to overlap at the focal plane of the objective lens. The different wavelengths then only interfere at the overlapping volume, if no further spatial or temporal dispersion is introduced, so that the intense pulsed illumination is retrieved and capable of yielding cross-sectioned images. The axial resolution is typically 2-3 μm^[4][5] even with structured illumination techniques.^[10][11] The spatial dispersion generated by the diffraction grating ensures that the energy in the laser is spread over a wider area in the objective lens, hence reducing the possibility of damaging the lens itself.

In contrast to what was initially thought, temporal focusing is remarkably robust to scattering.^[12] Its ability to penetrate through turbid media with minimal speckle was used in optogenetics, enabling photo-excitation of arbitrary light patterns through tissue.^[12] Temporal focusing was later combined with single-pixel detection to overcome the effect of scattering on fluorescent photons.^[13] This technique, called TRAFIX, enabled wide-field imaging through biological tissue at great depths with higher signal-to-background ratio and lower photobleaching than standard point-scanning two-photon microscopy.^[13]

Another simpler method consists of two beams that are loosely focused and overlapped onto an area (~100 μm) on the sample.^[2][3] With this method it is possible to have access to all the elements of the ${\displaystyle \chi ^{(2)}}$tensor gracias a la capacidad de poder cambiar la polarización de cada haz de forma independiente.