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Dispersión de luz estática

La dispersión de luz estática es una técnica de química física que mide la intensidad de la luz dispersada para obtener el peso molecular promedio M w de una macromolécula , com...

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La dispersión de luz estática es una técnica de química física que mide la intensidad de la luz dispersada para obtener el peso molecular promedio M w de una macromolécula , como un polímero o una proteína en solución. La medición de la intensidad de dispersión en múltiples ángulos permite calcular el radio cuadrático medio , también llamado radio de giro R g . Al medir la intensidad de dispersión para muchas muestras de diversas concentraciones, se puede calcular el segundo coeficiente virial, A 2. [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ]

La dispersión de luz estática también se utiliza comúnmente para determinar el tamaño de suspensiones de partículas en los rangos submicrométrico y supramicrométrico, mediante los formalismos de difracción de Lorenz-Mie (véase dispersión de Mie ) y Fraunhofer , respectivamente.

Para los experimentos de dispersión de luz estática, se lanza una luz monocromática de alta intensidad, generalmente un láser, a una solución que contiene las macromoléculas. Se utilizan uno o varios detectores para medir la intensidad de la dispersión en uno o varios ángulos. La dependencia angular es necesaria para obtener mediciones precisas tanto de la masa molar como del tamaño de todas las macromoléculas con un radio superior al 1-2% de la longitud de onda incidente. Por lo tanto, las mediciones simultáneas en varios ángulos con respecto a la dirección de la luz incidente, conocidas como dispersión de luz multiángulo (MALS) o dispersión de luz láser multiángulo (MALLS), se consideran generalmente la implementación estándar de la dispersión de luz estática. Se pueden encontrar detalles adicionales sobre la historia y la teoría de MALS en dispersión de luz multiángulo .

Para medir el peso molecular promedio directamente a partir de la intensidad de dispersión de la luz sin calibración, es necesario conocer la intensidad del láser, la eficiencia cuántica del detector, el volumen de dispersión total y el ángulo sólido del detector. Dado que esto resulta poco práctico, todos los instrumentos comerciales se calibran utilizando un dispersor fuerte y conocido, como el tolueno, ya que la relación de Rayleigh del tolueno y de algunos otros disolventes se midió con un instrumento de dispersión de luz absoluto.

Teoría

En un instrumento de dispersión de luz compuesto por múltiples detectores colocados en distintos ángulos, todos deben responder de la misma manera. Generalmente, los detectores presentan eficiencias cuánticas y ganancias ligeramente diferentes, y analizan volúmenes de dispersión geométricos distintos. En este caso, es imprescindible normalizar los detectores. Para ello, primero se realiza una medición de un disolvente puro. A continuación, se añade un dispersor isotrópico al disolvente. Dado que los dispersores isotrópicos dispersan la misma intensidad en cualquier ángulo, la eficiencia y la ganancia del detector pueden normalizarse mediante este procedimiento. Es conveniente normalizar todos los detectores con respecto al detector situado a 90°.

 norte(θ)=IR(θ)−IS(θ)IR(90)−IS(90){\displaystyle \ N(\theta )={\frac {I_{R}(\theta )-I_{S}(\theta )}{I_{R}(90)-I_{S}(90)}}}

donde I R (90) es la intensidad de dispersión medida para el dispersor de Rayleigh por el detector de ángulo de 90°.

La ecuación más común para medir el peso molecular promedio ponderado, M w , es la ecuación de Zimm [ 5 ] (el lado derecho de la ecuación de Zimm se proporciona incorrectamente en algunos textos, como señalan Hiemenz y Lodge): [ 6 ]

KdoΔR(θ,do)=1METROw(1+q2Rgramo23+O(q4))+2A2do+O(do2){\displaystyle {\frac {Kc}{\Delta R(\theta ,c)}}={\frac {1}{M_{w}}}\left(1+{\frac {q^{2}R_{g}^{2}}{3}}+O(q^{4})\right)+2A_{2}c+O(c^{2})}

dónde

 K=4π2norte02(dnorte/ddo)2/norteAλ4{\displaystyle \ K=4\pi ^{2}n_{0}^{2}(dn/dc)^{2}/N_{\text{A}}\lambda ^{4}}

y

 ΔR(θ,do)=RA(θ)−R0(θ){\displaystyle \ \Delta R(\theta ,c)=R_{A}(\theta )-R_{0}(\theta )}

con

 R(θ)=IA(θ)norte02IT(θ)norteT2RTnorte(θ){\displaystyle \ R(\theta )={\frac {I_{A}(\theta )n_{0}^{2}}{I_{T}(\theta )n_{T}^{2}}}{\frac {R_{T}}{N(\theta )}}}

y el vector de dispersión para la luz polarizada verticalmente es

 q=4πnorte0pecado⁡(θ/2)/λ{\displaystyle \ q=4\pi n_{0}\sin(\theta /2)/\lambda }

donde n 0 es el índice de refracción del disolvente, λ la longitud de onda de la fuente de luz, N A la constante de Avogadro , c la concentración de la solución y d n /d c el cambio en el índice de refracción de la solución con el cambio de concentración. La intensidad del analito medida en un ángulo es I A (θ) . En estas ecuaciones, el subíndice A es para el analito (la solución) y T es para el tolueno con la relación de Rayleigh del tolueno, R T siendo 1,35×10 −5  cm −1 para un láser HeNe . Como se describió anteriormente, el radio de giro, R g , y el segundo coeficiente virial, A 2 , también se calculan a partir de esta ecuación. El incremento del índice de refracción dn/dc caracteriza el cambio del índice de refracción n con la concentración c y se puede medir con un refractómetro diferencial.

Un gráfico de Zimm se construye a partir de una doble extrapolación a ángulo cero y concentración cero desde múltiples ángulos y múltiples mediciones de concentración. En su forma más simple, la ecuación de Zimm se reduce a:

 Kdo/ΔR(θ→0,do→0)=1/METROw{\displaystyle \ Kc/\Delta R(\theta \rightarrow 0,c\rightarrow 0)=1/M_{w}}

para mediciones realizadas en ángulo bajo y dilución infinita ya que P (0) = 1.

Generalmente se desarrollan varios análisis para analizar la dispersión de partículas en solución y así obtener las características físicas de las partículas mencionadas anteriormente. Un experimento sencillo de dispersión de luz estática implica que la intensidad promedio de la muestra, corregida por la dispersión del disolvente, dará como resultado la relación de Rayleigh , R, en función del ángulo o del vector de onda q, como sigue:

Análisis de datos

Trama de Guinier

La intensidad dispersa se puede representar gráficamente en función del ángulo para obtener información sobre R g , que se puede calcular simplemente utilizando la aproximación de Guinier (desarrollada por André Guinier ) de la siguiente manera:

ln⁡(ΔR(θ))=1−(Rgramo2/3)q2{\displaystyle \ln(\Delta R(\theta ))=1-(R_{g}^{2}/3)q^{2}}

donde ln(Δ R ( θ )) = ln P ( θ ) también conocido como factor de forma con q = 4πn 0 sin( θ /2)/ λ . Por lo tanto, una gráfica de la relación de Rayleigh corregida , Δ R ( θ ) frente a sin 2 ( θ /2) o q 2 dará una pendiente R g 2 /3 . Sin embargo, esta aproximación solo es cierta para qR g < 1 . Nótese que para una gráfica de Guinier, el valor de dn/dc y la concentración no son necesarios.

Trama de Kratky

El gráfico de Kratky se utiliza normalmente para analizar la conformación de las proteínas , pero también puede utilizarse para analizar el modelo de paseo aleatorio de los polímeros . Un gráfico de Kratky puede crearse graficando sin² (θ/2)ΔR(θ) frente a sin(θ/2) o q²ΔR ( θ) frente a q .

Gráfico de Zimm

La doble extrapolación a concentración cero y ángulo de dispersión cero se utiliza en el gráfico de Zimm.
Evaluación de la medición de dispersión de luz estática mediante el diagrama de Zimm.

Para polímeros y complejos poliméricos que son monodispersos (μ2/Γ¯2<0,3{\displaystyle \scriptstyle \mu _{2}/{\bar {\Gamma }}^{2}<0.3}) según lo determinado por la dispersión de luz estática, un gráfico de Zimm es un medio convencional para derivar parámetros como R g , masa molecular M w y el segundo coeficiente virial A 2 .

Cabe señalar que si no se implementa la constante del material K , un gráfico de Zimm solo arrojará R g . Por lo tanto, la implementación de K dará como resultado la siguiente ecuación:

KdoΔR(θ,do)=1METROw(1+q2Rgramo23+O(q4))+2A2do+O(do2){\displaystyle {\frac {Kc}{\Delta R(\theta ,c)}}={\frac {1}{M_{w}}}\left(1+{\frac {q^{2}R_{g}^{2}}{3}}+O(q^{4})\right)+2A_{2}c+O(c^{2})}

El análisis realizado con el gráfico de Zimm utiliza una doble extrapolación a concentración cero y ángulo de dispersión cero, lo que da como resultado un gráfico romboidal característico. Como se dispone de la información angular, también es posible obtener el radio de giro ( R g ). Los experimentos se realizan en varios ángulos que satisfacen la condiciónqRgramo<1{\displaystyle qR_{g}<1}y al menos 4 concentraciones. Realizar un análisis de Zimm en una sola concentración se conoce como análisis de Zimm parcial y solo es válido para soluciones diluidas de dispersores puntuales fuertes . Sin embargo, el análisis de Zimm parcial no proporciona el segundo coeficiente virial , debido a la ausencia de la concentración variable de la muestra. Más específicamente, para realizar el análisis de Zimm parcial, se asume que el valor del segundo coeficiente virial es cero o se introduce como un valor conocido.

Trama de Debye

Cálculo de la masa molecular mediante medición de dispersión de luz estática utilizando el diagrama de Debye [ 7 ]

Si las partículas medidas son más pequeñas que λ/20, el factor de forma P(θ) puede despreciarse ( P(θ) →1). Por lo tanto, la ecuación de Zimm se simplifica a la ecuación de Debye, como sigue:

KdoΔR(θ,do)=1METROw+2A2do{\displaystyle {\frac {Kc}{\Delta R(\theta ,c)}}={\frac {1}{M_{w}}}+2A_{2}c}

Cabe destacar que este resultado también se obtiene mediante una extrapolación a un ángulo de dispersión cero. Al adquirir datos sobre la concentración y la intensidad de dispersión, se construye el diagrama de Debye representando Kc / ΔR(θ) frente a la concentración. La intersección de la línea ajustada proporciona la masa molecular, mientras que la pendiente corresponde al segundo coeficiente virial.

Como el diagrama de Debye es una simplificación de la ecuación de Zimm, se aplican las mismas limitaciones de esta última; es decir, las muestras deben presentar una naturaleza monodispersa. Para muestras polidispersas, la masa molecular resultante de una medición de dispersión de luz estática representará un valor promedio. Una ventaja del diagrama de Debye es la posibilidad de determinar el segundo coeficiente virial. Este parámetro describe la interacción entre las partículas y el disolvente. En soluciones de macromoléculas, por ejemplo, puede tomar valores negativos (se favorecen las interacciones partícula-partícula), cero o positivos (se favorecen las interacciones partícula-disolvente). [ 8 ]

Dispersión múltiple

La dispersión de luz estática asume que cada fotón detectado se ha dispersado exactamente una vez. Por lo tanto, el análisis según los cálculos mencionados anteriormente solo será correcto si la muestra se ha diluido lo suficiente para asegurar que los fotones no se dispersen varias veces antes de ser detectados. La interpretación precisa se vuelve extremadamente difícil para sistemas con contribuciones no despreciables de dispersión múltiple. En muchos instrumentos comerciales donde el análisis de la señal de dispersión se realiza automáticamente, el usuario puede no percibir el error. Particularmente para partículas grandes y aquellas con un alto contraste de índice de refracción, esto limita la aplicación de la dispersión de luz estática estándar a concentraciones de partículas muy bajas. Por otro lado, para macromoléculas solubles que presentan un contraste de índice de refracción relativamente bajo con respecto al disolvente, incluyendo la mayoría de los polímeros y biomoléculas en sus respectivos disolventes, la dispersión múltiple rara vez es un factor limitante, incluso a concentraciones cercanas a los límites de solubilidad.

Sin embargo, como demostró Schaetzel, [ 9 ] es posible suprimir la dispersión múltiple en experimentos de dispersión de luz estática mediante un enfoque de correlación cruzada . La idea general es aislar la luz dispersada una sola vez y suprimir las contribuciones no deseadas de la dispersión múltiple en un experimento de dispersión de luz estática. Se han desarrollado y aplicado diferentes implementaciones de dispersión de luz por correlación cruzada. Actualmente, el esquema más utilizado es el llamado método de dispersión de luz dinámica 3D, [ 10 ] [ 11 ]. El mismo método también se puede utilizar para corregir los datos de dispersión de luz dinámica para las contribuciones de dispersión múltiple. [ 12 ]

Dispersión de luz estática con gradiente de composición

Las muestras que cambian sus propiedades después de la dilución no pueden analizarse mediante dispersión de luz estática según el modelo simple presentado aquí como la ecuación de Zimm. Un análisis más sofisticado, conocido como "dispersión de luz estática (o multiángulo) con gradiente de composición" (CG-SLS o CG-MALS), es una clase importante de métodos para investigar las interacciones proteína-proteína , las propiedades coligativas y otras interacciones macromoleculares, ya que proporciona, además del tamaño y el peso molecular, información sobre la afinidad y la estequiometría de los complejos moleculares formados por una o más especies macromoleculares/biomoleculares asociadas. En particular, la dispersión de luz estática de una serie de diluciones puede analizarse para cuantificar la autoasociación, la oligomerización reversible y la atracción o repulsión no específica, mientras que la dispersión de luz estática de mezclas de especies puede analizarse para cuantificar la heteroasociación. [ 13 ]

Aplicaciones

Una de las principales aplicaciones de la dispersión de luz estática para la determinación de la masa molecular se encuentra en el campo de las macromoléculas, como las proteínas y los polímeros, [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ] ya que permite medir la masa molecular de las proteínas sin ninguna suposición sobre su forma. La dispersión de luz estática se suele combinar con otras técnicas de caracterización de partículas, como la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), la dispersión de luz dinámica (DLS) y la dispersión de luz electroforética (ELS).

Véase también

Referencias

  1. ^ A. Einstein (1910). "Theorie der Opaleszenz von homogenen Flüssigkeiten und Flüssigkeitsgemischen in der Nähe des kritischen Zustandes" . Anales de Física . 33 (16): 1275. Bibcode : 1910AnP...338.1275E . doi : 10.1002/andp.19103381612 .
  2. ↑ CV Raman (1927). "Relación del efecto Tyndall con la presión osmótica en soluciones coloidales". Indian J. Phys . 2 :1.
  3. ↑ P. Debye (1944). "Dispersión de la luz en soluciones". J. Appl. Phys . 15 (4): 338. Bibcode : 1944JAP....15..338D . doi : 10.1063/1.1707436 .
  4. ↑ BH Zimm (1945). "Teoría molecular de la dispersión de la luz en fluidos". J. Chem. Phys . 13 (4): 141. Bibcode : 1945JChPh..13..141Z . doi : 10.1063/1.1724013 .
  5. 1 2 B.H. Zimm (1948). "La dispersión de la luz y la función de distribución radial de soluciones de polímeros de alta concentración". J. Chem. Phys . 16 (12): 1093. Bibcode : 1948JChPh..16.1093Z . doi : 10.1063/1.1746738 .
  6. ^ Hiemenz, Paul C.; Logia, Timothy P. (2007). Química de polímeros (2ª ed.). Boca Ratón, Florida [ua]: CRC Press. págs. 307–308 . ISBN   978-1-57444-779-8.
  7. ↑ "Medición de masa molecular mediante dispersión de luz estática :: Anton Paar Wiki" . Anton Paar . Consultado el 23 de septiembre de 2022 . 
  8. ↑ Chang, Qing (2016), "Presión osmótica" , Química coloidal e interfacial para el control de la calidad del agua , Elsevier, pp. 37–47 , doi : 10.1016/b978-0-12-809315-3.00004-9 , ISBN  978-0-12-809315-3Consultado el 14 de junio de 2022.
  9. ↑ Schaetzel, K. (1991). "Supresión de la dispersión múltiple mediante técnicas de correlación cruzada de fotones". J. Mod. Opt . 38 : SA393– SA398. Bibcode : 1990JPCM....2..393S . doi : 10.1088/0953-8984/2/S/062 . S2CID 250745836 . 
  10. ↑ Urban, C.; Schurtenberger, P. (1998). "Caracterización de suspensiones coloidales turbias mediante técnicas de dispersión de luz combinadas con métodos de correlación cruzada". J. Colloid Interface Sci . 207 (1): 150– 158. Bibcode : 1998JCIS..207..150U . doi : 10.1006/jcis.1998.5769 . PMID 9778402 . 
  11. ↑ Block, I.; Scheffold, F. (2010). "Dispersión de luz por correlación cruzada 3D modulada: mejora de la caracterización de muestras turbias". Review of Scientific Instruments . 81 (12): 123107–123107–7. arXiv : 1008.0615 . Bibcode : 2010RScI...81l3107B . doi : 10.1063/1.3518961 . PMID 21198014 . S2CID 9240166 .  
  12. ↑ Pusey, PN (1999). "Supresión de la dispersión múltiple mediante técnicas de correlación cruzada de fotones". Current Opinion in Colloid & Interface Science . 4 (3): 177– 185. doi : 10.1016/S1359-0294(99)00036-9 .
  13. ↑ Some, D. (2013). " Análisis de interacciones biomoleculares basado en la dispersión de la luz" . Biophys. Rev. 5 ( 2): 147– 158. doi : 10.1007/s12551-013-0107-1 . PMC 3641300. PMID 23646069 .  
  14. ↑ Sedlák, Marián (1 de marzo de 2006). "Estructura supramolecular a gran escala en soluciones de compuestos de baja masa molar y mezclas de líquidos: I. Caracterización por dispersión de luz" . The Journal of Physical Chemistry B. 110 ( 9): 4329–4338 . doi : 10.1021/jp0569335 . ISSN 1520-6106 . PMID 16509731 .  
  15. ↑ Díaz‐Lasprilla, Ana M.; Mercado, Ronald A.; Ramírez‐Caballero, Gustavo E. (20 de junio de 2021). "Efecto del grado de polimerización del glicerol en las propiedades emulsionantes de los ésteres de poliglicerol" . Journal of Applied Polymer Science . 138 (24) 50566. doi : 10.1002/app.50566 . ISSN 0021-8995 . S2CID 233888953 .  
  16. ↑ "Dimerización de la albúmina sérica bovina evidenciada mediante la medición del tamaño de partícula y la masa molecular :: Anton-Paar.com" . Anton Paar . Consultado el 14 de junio de 2022 . 
  • Aplicación de la dispersión de luz estática
  • Litesizer