acetoacetato descarboxilasa

La acetoacetato descarboxilasa ( AAD o ADC ) es una enzima ( EC 4.1.1.4 ) involucrada tanto en la vía de producción de cuerpos cetónicos en humanos y otros mamíferos, como en la solventogénesis en bacterias. La acetoacetato descarboxilasa desempeña un papel clave en la producción de solventes al catalizar la descarboxilación del acetoacetato, produciendo acetona y dióxido de carbono . ^{[ 1 ]}

Esta enzima ha sido de particular interés porque es un ejemplo clásico de cómo los valores de pKa de los grupos ionizables en el sitio activo de la enzima pueden verse significativamente alterados. Específicamente, el valor de pKa de la lisina 115 en el sitio activo es inusualmente bajo, lo que permite la formación de un intermedio de base de Schiff y la catálisis. ^{[ 2 ]}

La acetoacetato descarboxilasa es una enzima con importantes implicaciones históricas, específicamente en la Primera Guerra Mundial y en el establecimiento del estado de Israel . ^{[ 3 ]} Durante la guerra, los Aliados necesitaban acetona pura como disolvente para la nitrocelulosa , un compuesto altamente inflamable que es el componente principal de la pólvora. ^{[ 4 ]} En 1916, el bioquímico y futuro primer presidente de Israel, Chaim Weizmann, fue el primero en aislar Clostridium acetobutylicum , una bacteria anaeróbica Gram-positiva en la que se encuentra la acetoacetato descarboxilasa. Weizmann logró aprovechar la capacidad del organismo para producir acetona a partir de almidón con el fin de producir explosivos en masa durante la guerra. ^{[ 3 ]} Esto llevó a los gobiernos estadounidense y británico a instalar el proceso ideado por Chaim Weizmann en varias grandes plantas en Inglaterra, Francia, Canadá y Estados Unidos. A través de las contribuciones científicas de Weizmann en la Primera Guerra Mundial, entabló una estrecha relación con influyentes líderes británicos, a quienes les transmitió sus creencias sionistas. ^{[ 5 ]} Uno de ellos fue Arthur Balfour, el hombre que da nombre a la Declaración Balfour , el primer documento que declaraba el apoyo británico al establecimiento de una patria judía.

La producción de acetona mediante bacterias clostridiales o que contienen acetoacetato descarboxilasa se utilizó en síntesis industriales a gran escala durante la primera mitad del siglo XX. En la década de 1960, la industria reemplazó este proceso con síntesis químicas de acetona más económicas y eficientes a partir de petróleo y derivados del petróleo. ^{[ 6 ]} Sin embargo, ha habido un creciente interés en la producción de acetona más respetuosa con el medio ambiente, lo que ha provocado un resurgimiento en el uso de bacterias que contienen acetoacetato descarboxilasa. ^{[ 7 ]} De manera similar, la fermentación de isopropanol y butanol utilizando especies clostridiales también se está popularizando.

La acetoacetato descarboxilasa es un complejo de 365 kDa con una estructura homododecamérica. ^{[ 8 ]} La estructura general consiste en láminas β antiparalelas y un barril β central de siete hebras en forma de cono . El núcleo de este barril β rodea el sitio activo en cada protómero de la enzima. El sitio activo, que consta de residuos como Phe 27, Met97 y Tyr113 , es mayoritariamente hidrofóbico . Sin embargo, el sitio activo contiene dos residuos cargados: Arg29 y Glu76 .

Se cree que Arg29 participa en la unión del sustrato, mientras que Glu76 interviene en la orientación del sitio activo para la catálisis. El entorno hidrofóbico general del sitio activo es fundamental para favorecer la forma amina neutra de Lys115, un residuo clave en la formación de un intermedio de base de Schiff . Se considera que otro residuo de lisina importante, Lys116, desempeña un papel crucial en el posicionamiento de Lys115 en el sitio activo. Mediante enlaces de hidrógeno con Ser16 y Met210 , Lys116 posiciona a Lys115 en el bolsillo hidrofóbico del sitio activo para favorecer la forma amina neutra.

La acetoacetato descarboxilasa de Clostridium acetobutylicum cataliza la descarboxilación del acetoacetato para producir acetona y dióxido de carbono (Figura 1). El mecanismo de reacción procede a través de la formación de un intermedio de base de Schiff , que se une covalentemente a la lisina 115 en el sitio activo. La primera evidencia que respalda este mecanismo provino de un experimento de radiomarcaje en el que los investigadores marcaron el grupo carbonilo del acetoacetato con ^18O y observaron que el intercambio de oxígeno con agua, utilizada como disolvente, es una parte necesaria de la etapa de descarboxilación. ^{[ 9 ]} Estos resultados respaldaron que el mecanismo procede a través de un intermedio de base de Schiff entre el cetoácido y un residuo de aminoácido en la enzima.

Investigaciones posteriores llevaron al aislamiento de una secuencia peptídica del sitio activo y a la identificación de la lisina del sitio activo, Lys115, que participa en la formación del intermedio de base de Schiff. ^{[ 2 ] [ 10 ]} Además, experimentos posteriores llevaron al hallazgo de que la actividad máxima de la enzima ocurre a pH 5,95, lo que sugiere que el pK a del grupo ε-amonio de Lys115 se ve significativamente perturbado en el sitio activo. ^{[ 2 ]} Si el pK a no se perturbara hacia abajo, el residuo de lisina permanecería protonado como un catión amonio, haciéndolo no reactivo para la adición nucleofílica necesaria para formar la base de Schiff.

Partiendo de este hallazgo, Westheimer et al. midieron directamente el pK a de Lys115 en el sitio activo utilizando 5-nitrosalicilaldehído (5-NSA). La reacción de 5-NSA con acetoacetato descarboxilasa y la posterior reducción de la base de Schiff resultante con borohidruro de sodio condujo a la incorporación de una molécula reportera de 2-hidroxi-5-nitrobenzilamino en el sitio activo (Figura 2). La titulación de la enzima con este grupo reportero unido reveló que el pK a de Lys115 disminuye a 5,9 en el sitio activo. ^{[ 12 ]} Estos resultados fueron la base para la propuesta de que la perturbación en el pK a de Lys115 se debía a su proximidad al grupo ε-amonio cargado positivamente de Lys116 en el sitio activo. ^{[ 2 ]} Una carga positiva cercana podría causar repulsiones electrostáticas desfavorables que debilitan el enlace NH de Lys115. La propuesta de Westheimer et al. fue respaldada además por estudios de mutagénesis dirigida . Cuando Lys116 se mutó a cisteína o asparagina , se encontró que el pK a de Lys115 se elevó significativamente a más de 9,2, lo que indica que Lys116, con carga positiva, desempeña un papel crítico en la determinación del pK a de Lys115. ^{[ 2 ]} Aunque aún no se había resuelto una estructura cristalina para proporcionar evidencia estructural, esta propuesta fue ampliamente aceptada y citada como un ejemplo clásico de cómo el sitio activo puede organizarse con precisión para perturbar un pK a y afectar la reactividad. ^{[ 8 ]}

En 2009, se resolvió la estructura cristalina de la acetoacetato descarboxilasa de Clostridium acetobutylicum , lo que permitió evaluar la propuesta de Westheimer et al. desde una nueva perspectiva. A partir de la estructura cristalina, los investigadores encontraron que Lys 115 y Lys 116 están orientados en direcciones opuestas y separados por 14,8 Å (Figura 3). ^{[ 8 ]} Esta distancia hace improbable que la carga positiva de Lys116 pueda afectar el pK a de Lys115. En cambio, a través de enlaces de hidrógeno con Ser16 y Met210, Lys116 probablemente mantiene a Lys115 en posición en un bolsillo hidrofóbico del sitio activo. Este posicionamiento altera la estabilidad del catión amonio protonado de Lys115, lo que sugiere que la perturbación del pK a de Lys115 ocurre a través de un " efecto de desolvatación ".

La acetoacetato descarboxilasa es inhibida por varios compuestos. El anhídrido acético realiza un ataque electrofílico sobre el residuo catalítico crítico , Lys115, de la acetoacetato descarboxilasa para inactivar la enzima. ^{[ 13 ]} La tasa de inactivación se evaluó mediante la hidrólisis del sustrato sintético 2,4-dinitrofenil propionato a dinitrofenol por la acetoacetato descarboxilasa. En presencia de anhídrido acético, la enzima se inactiva, siendo incapaz de catalizar la reacción de hidrólisis de 2,4-dinitrofenil propionato a dinitrofenol. ^{[ 14 ]}

El acetonilsulfonato actúa como un inhibidor competitivo (K _I = 8,0 mM) ya que imita las características del sustrato natural, el acetoacetato (K _M = 8,0 mM). ^{[ 15 ]} La versión monoaniónica del acetonilfosfonato también es un buen inhibidor (K _I = 0,8 mM), más eficiente que el monoéster o el dianión del acetonilfosfonato. ^{[ 16 ]} Estos hallazgos indican que el sitio activo es muy selectivo y está estéricamente restringido.

El cianuro de hidrógeno parece ser un inhibidor no competitivo , que se combina con los compuestos de base de Schiff formados en el sitio activo. ^{[ 15 ]} La adición de compuestos carbonílicos a la enzima, en presencia de cianuro de hidrógeno, aumenta la capacidad de este último para inhibir la acetoacetato descarboxilasa, lo que sugiere que los compuestos carbonílicos forman fácilmente bases de Schiff en el sitio activo. El cianuro de hidrógeno es más potente como inhibidor a pH 6, el pH óptimo para la enzima, lo que sugiere que la etapa limitante de la velocidad de catálisis es la formación del intermedio de base de Schiff.

Las beta-dicetonas parecen inhibir la acetoacetato descarboxilasa de manera eficaz pero lenta. La acetoacetato descarboxilasa tiene una K _M para el acetoacetato de 7×10 ⁻³ M, mientras que la enzima tiene una K _I para la benzoilacetona de 1,9×10 ⁻⁶ M. ^{[ 15 ]} Lo más probable es que se forme una enamina tras la interacción de las beta-dicetonas con la enzima libre.

La reacción de la acetoacetato descarboxilasa con p -cloromercurifenilsulfonato (CMS) produce una disminución de la actividad catalítica con dos equivalentes de CMS por subunidad enzimática. ^{[ 15 ]} El CMS interactúa con dos grupos sulfhidrilo ubicados en cada subunidad enzimática. La inactivación aumenta al añadir un tercer equivalente de CMS por subunidad. La adición de cisteína libre a la enzima inhibida puede revertir la inhibición de la acetoacetato descarboxilasa por el CMS.

La acetoacetato descarboxilasa se ha encontrado y estudiado en las siguientes bacterias, además de en Clostridium acetobutylicum :

• Bacillus polymyxa
• Chromobacterium violaceum
• Clostridium beijerinckii
• Clostridium cellulolyticum
• Pseudomonas putida

Aunque esta enzima no se ha purificado a partir de tejido humano, se ha demostrado que su actividad está presente en el suero sanguíneo humano. ^{[ 17 ] [ 18 ]} La actividad de la acetoacetato descarboxilasa se atribuye principalmente a la albúmina sérica humana ; sin embargo, la actividad es aproximadamente${\displaystyle 10^{-4}}$veces la de la acetoacetato descarboxilasa real ( C. acetobutylicum ). ^{[ 19 ]}

En humanos y otros mamíferos, la conversión de acetoacetato en acetona y dióxido de carbono por la acetoacetato descarboxilasa es un paso final irreversible en la vía de los cuerpos cetónicos que proporciona al cuerpo una fuente secundaria de energía. ^{[ 20 ]} En el hígado, el acetil co-A formado a partir de grasas y lípidos se transforma en tres cuerpos cetónicos: acetoacetato , D-β-hidroxibutirato y acetona . El acetoacetato y el D-β-hidroxibutirato se exportan a tejidos extrahepáticos, donde se convierten de nuevo en acetil co-A y se utilizan como combustible. La acetona y el dióxido de carbono, por otro lado, se exhalan y no se acumulan en condiciones normales.

El acetoacetato y el D-β-hidroxibutirato se interconvierten libremente mediante la acción de la D-β-hidroxibutirato deshidrogenasa. ^{[ 20 ]} Posteriormente, una función de la acetoacetato descarboxilasa puede ser regular las concentraciones de los otros dos cuerpos cetónicos de 4 carbonos.

La producción de cuerpos cetónicos aumenta significativamente cuando la tasa de metabolismo de la glucosa es insuficiente para satisfacer las necesidades energéticas del organismo. Estas condiciones incluyen dietas cetogénicas ricas en grasas , cetoacidosis diabética o inanición severa. ^{[ 21 ]}

Bajo niveles elevados de acetoacetato y D-β-hidroxibutirato, la acetoacetato descarboxilasa produce una cantidad significativamente mayor de acetona. La acetona es tóxica y puede acumularse en el organismo en estas condiciones. Los niveles elevados de acetona en el aliento humano pueden utilizarse para diagnosticar la diabetes. ^{[ 21 ]}

• acetoacetato+descarboxilasa en los Encabezamientos de Materias Médicas (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.
• CE 4.1.1.4
• Brenda: Entrada de acetoacetato descarboxilasa
• KEGG: Entrada de acetoacetato descarboxilasa
• InterPro: IPR010451 Acetoacetato descarboxilasa