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Aequorina

La aequorina es una fotoproteína activada por calcio aislada del hidrozoo Aequorea victoria . [1] Su bioluminiscencia fue estudiada décadas antes de que la proteína fuera aislad...

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La aequorina es una fotoproteína activada por calcio aislada del hidrozoo Aequorea victoria . [1] Su bioluminiscencia fue estudiada décadas antes de que la proteína fuera aislada del animal por Osamu Shimomura en 1962. [2] En el animal, la proteína se presenta junto con la proteína fluorescente verde para producir luz verde por transferencia de energía resonante , mientras que la aequorina por sí sola genera luz azul.

Las discusiones sobre el "ADN de medusa" que puede producir animales "brillantes" a menudo se refieren a animales transgénicos que expresan la proteína fluorescente verde, no aequorina, aunque ambas derivan originalmente del mismo animal.

La apoaequorina, la porción proteínica de la aequorina, es un ingrediente del suplemento dietético Prevagen. La Comisión Federal de Comercio de Estados Unidos (FTC) ha acusado al fabricante de hacer publicidad engañosa por sus afirmaciones sobre la mejora de la memoria.

Descubrimiento

El trabajo sobre la aequorina comenzó con E. Newton Harvey en 1921. [3] Aunque Harvey no pudo demostrar una reacción clásica de luciferasa - luciferina , demostró que el agua podía producir luz a partir de fotocitos secos y que la luz podía producirse incluso en ausencia de oxígeno. Más tarde, Osamu Shimomura comenzó a trabajar en la bioluminiscencia de Aequorea en 1961. Esto implicó la tediosa recolección de decenas de miles de medusas de los muelles de Friday Harbor, Washington . [1] Se determinó que la luz podía producirse a partir de extractos con agua de mar, y más específicamente, con calcio . [2] También se observó que durante la extracción el animal crea luz verde debido a la presencia de la proteína fluorescente verde , que cambia la luz azul nativa de la aequorina a verde. [4]

Aunque el foco principal de su trabajo estaba en la bioluminiscencia, [5] Shimomura y otros dos, Martin Chalfie y Roger Tsien , recibieron el Premio Nobel en 2008 por su trabajo sobre las proteínas fluorescentes verdes .

Estructura

La aequorina es una holoproteína compuesta por dos unidades distintas, la apoproteína que se llama apoaequorina , que tiene un peso molecular aproximado de 21 kDa , y el grupo prostético coelenterazina , la luciferina. [6] Es decir, la apoaequorina es la enzima producida en los fotocitos del animal, y la coelenterazina es el sustrato cuya oxidación cataliza la enzima. Cuando la coelenterazina está unida, se llama aequorina. Cabe destacar que la proteína contiene tres motivos de mano EF que funcionan como sitios de unión para los iones Ca 2+ . [7] La ​​proteína es miembro de la superfamilia de las proteínas de unión al calcio, de las cuales hay unas 66 subfamilias. [8]

La estructura cristalina reveló que la aequorina se une a la coelenterazina y al oxígeno en forma de peróxido , coelenterazina-2-hidroperóxido. [9] El sitio de unión de los dos primeros átomos de calcio muestra una afinidad 20 veces mayor por el calcio que el tercer sitio. [10] Sin embargo, afirmaciones anteriores de que solo dos manos EF se unen al calcio [11] fueron cuestionadas cuando estructuras posteriores indicaron que los tres sitios pueden de hecho unirse al calcio. [12] Por lo tanto, los estudios de titulación muestran que los tres sitios de unión al calcio están activos, pero solo se necesitan dos iones para desencadenar la reacción enzimática. [13]

Otros estudios han demostrado la presencia de un enlace interno de cisteína que mantiene la estructura de la aequorina. [14] Esto también ha explicado la necesidad de un reactivo tiol como el beta mercaptoetanol en la regeneración de la proteína, ya que dichos reactivos debilitan los enlaces sulfhidrilo entre los residuos de cisteína , acelerando la regeneración de la aequorina.

La caracterización química de la aequorina indica que la proteína es algo resistente a tratamientos agresivos. La aequorina es resistente al calor. [15] Mantenida a 95 °C durante 2 minutos, la proteína perdió solo el 25% de su actividad. Los desnaturalizantes como urea 6-M o clorhidrato de guanidina 4-M no destruyeron la proteína.

Genética

Se presume que la aequorina está codificada en el genoma de Aequorea. Se recuperaron al menos cuatro copias del gen como ADNc del animal. [16] [17] Debido a que el genoma no ha sido secuenciado, no está claro si las variantes de ADNc pueden explicar todas las isoformas de la proteína. [18]

Mecanismo de acción

Los primeros estudios de la bioluminiscencia de Aequorea por E. Newton Harvey habían notado que la bioluminiscencia aparece como un anillo alrededor de la campana, y ocurre incluso en ausencia de aire. [19] Esto fue notable porque la mayoría de las reacciones de bioluminiscencia requieren oxígeno , y condujo a la idea de que los animales de alguna manera almacenan oxígeno. [20] Más tarde se descubrió que la apoproteína puede unirse de manera estable a la coelenterazina-2-hidroperóxido, y se requiere oxígeno para la regeneración de esta forma activa de aequorina. [21] Sin embargo, en presencia de iones de calcio , la proteína sufre un cambio conformacional y convierte su grupo prostético, coelenterazina-2-hidroperóxido, en coelenteramida excitada y CO 2 . [22] A medida que la coelenteramida excitada se relaja al estado fundamental, se emite luz azul ( longitud de onda de 465 nm). Antes de que se intercambie la coelenteramida, toda la proteína sigue siendo azul fluorescente. [23] [24] Debido a la conexión entre la bioluminiscencia y la fluorescencia , esta propiedad fue en última instancia importante en el descubrimiento de la luciferina coelenterazina . [25]

Aplicaciones

Dado que la luz emitida se puede detectar fácilmente con un luminómetro , la aequorina se ha convertido en una herramienta útil en biología molecular para la medición de los niveles intracelulares de Ca 2+ . [26] La temprana y exitosa purificación de la aequorina condujo a los primeros experimentos que involucraron la inyección de la proteína en los tejidos de animales vivos para visualizar la liberación fisiológica de calcio en las fibras musculares de un percebe. [27] Desde entonces, la proteína se ha utilizado ampliamente en muchos sistemas biológicos modelo , incluidos el pez cebra , [28] ratas , ratones y células cultivadas . [29] [30] [31] [32]

Las células cultivadas que expresan el gen de la aequorina pueden sintetizar apoaequorina de manera efectiva; sin embargo, la expresión recombinante produce solo la apoproteína . Por lo tanto, es necesario agregar coelenterazina al medio de cultivo de las células para obtener una proteína funcional y así usar su emisión de luz azul para medir la concentración de Ca 2+ . La coelenterazina es una molécula hidrófoba y, por lo tanto, se absorbe fácilmente a través de las paredes celulares de plantas y hongos , así como de la membrana plasmática de eucariotas superiores, lo que hace que la aequorina sea adecuada como reportero de Ca 2+ en plantas, hongos y células de mamíferos. [33] [34]

La aequorina tiene varias ventajas sobre otros indicadores de Ca 2+ . Debido a que la proteína es grande, tiene una baja tasa de fuga de las células en comparación con los colorantes lipofílicos como DiI . Carece de fenómenos de compartimentación o secuestro intracelular como se ve a menudo para los colorantes sensibles al voltaje , y no altera las funciones celulares o el desarrollo del embrión. Además, la luz emitida por la oxidación de la coelenterazina no depende de ninguna excitación óptica, por lo que se eliminan los problemas de autofluorescencia. [35] La principal limitación de la aequorina es que el grupo prostético coelenterazina se consume irreversiblemente para producir luz y requiere la adición continua de coelenterazina al medio. Tales problemas llevaron al desarrollo de otros sensores de calcio codificados genéticamente, incluido el sensor basado en calmodulina cameleon , [36] desarrollado por Roger Tsien y el sensor basado en troponina , TN-XXL , desarrollado por Oliver Griesbeck. [37]

La apoaequorina es un ingrediente de "Prevagen", que Quincy Bioscience comercializa como un suplemento para la memoria. En 2017, la Comisión Federal de Comercio de Estados Unidos (FTC) acusó al fabricante de anunciar falsamente que el producto mejora la memoria, brinda beneficios cognitivos y está "clínicamente demostrado" que funciona. [38] Según la FTC, "los comercializadores de Prevagen se aprovecharon de los temores de los consumidores mayores que experimentaban pérdida de memoria relacionada con la edad ". Quincy dijo que lucharía contra los cargos. [39] [40] [41]

Antes de la demanda, un ensayo clínico realizado por investigadores empleados por Quincy Bioscience "no encontró ningún beneficio general en comparación con un placebo para sus criterios de valoración principales relacionados con la memoria y la cognición", mientras que la publicidad de la empresa citó engañosamente algunos análisis de subgrupos controvertidos que mostraban ligeras mejoras. [42] [43]

La demanda ( Spath, et al. v. Quincy Bioscience Holding Company, Inc., et al. , caso n.º 18-cv-12416, D. NJ.) fue desestimada en el tribunal de distrito, pero se presentó una apelación para revocar la desestimación. La demanda se consolidó con otra contra Quincy Pharmaceuticals, Vanderwerff v. Quincy Bioscience (caso n.º 17-cv-784, D. NJ), que fue el caso principal. [44]

El 21 de febrero de 2019, el Tribunal de Apelaciones de los Estados Unidos para el Segundo Circuito dictaminó que la FTC y el estado de Nueva York podían proceder con su demanda contra Quincy Bioscience por sus afirmaciones de que Prevagen puede mejorar la memoria. La orden se produjo menos de dos semanas después de que las partes presentaran el caso ante un panel de tres jueces del circuito, donde los abogados de la empresa admitieron que no "disputaban que si se analiza a las 211 personas que completaron el estudio no había una diferencia estadísticamente significativa". El tribunal desestimó enérgicamente las acusaciones de los abogados de la empresa de que la FTC había llevado a cabo su acción por motivos políticos. [45] [46]

El 23 de marzo de 2020, un magistrado federal del Tribunal de Distrito de los Estados Unidos para el Distrito Sur de Florida emitió un informe y recomendaciones que certificaban una demanda colectiva a nivel nacional para el grupo de consumidores que compraron Prevagen durante los cuatro años anteriores. [47] El juicio en el caso se fijó para octubre de 2020. [47] [48]

A partir del 21 de septiembre de 2020 [actualizar], Quincy Bioscience acordó resolver las reclamaciones de que había tergiversado sus productos Prevagen como si apoyaran la salud cerebral y ayudaran con la pérdida de memoria. Según los términos del acuerdo, los compradores elegibles que presentaran su solicitud antes del 26 de octubre de 2020 por compras realizadas entre 2007 y el 31 de julio de 2020 podrían recuperar reembolsos de hasta $70. [49]

La Dra. Harriet Hall , que escribe para Science-Based Medicine , señaló que el estudio patrocinado por Quincy (conocido como "Madison Memory Study") fue negativo, pero que la empresa utilizó p-hacking para encontrar resultados favorables. Escribió que los estudios de seguridad citados eran todos estudios con ratas y que su afirmación de que la apoaequorina cruza la barrera hematoencefálica se basaba únicamente en un estudio con perros. [50] La Asociación Estadounidense de Farmacéuticos advierte que es poco probable que la apoaequorina "se absorba en un grado significativo; en cambio, se degrada en aminoácidos". [51]

Referencias

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