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En biología molecular , el escaneo de alanina es una técnica de mutagénesis dirigida al sitio que se utiliza para determinar la contribución de un residuo específico a la estabilidad o función de una proteína dada. [1] La alanina se utiliza debido a su grupo funcional metilo, que no es voluminoso y es químicamente inerte, pero que, sin embargo, imita las preferencias de estructura secundaria que poseen muchos de los otros aminoácidos. A veces, se utilizan aminoácidos voluminosos como la valina o la leucina en casos en los que se necesita conservar el tamaño de los residuos mutados.
Esta técnica también se puede utilizar para determinar si la cadena lateral de un residuo específico desempeña un papel importante en la bioactividad . Esto se logra generalmente mediante mutagénesis dirigida al sitio o de forma aleatoria mediante la creación de una biblioteca de PCR . Además, se han desarrollado métodos computacionales para estimar parámetros termodinámicos basados en sustituciones teóricas de alanina.
Esta técnica es rápida, ya que se analizan muchas cadenas laterales simultáneamente y se evita la necesidad de purificación de proteínas y análisis biofísico. [2] La tecnología está muy madura en este punto y se usa ampliamente en campos bioquímicos. Los datos se pueden probar mediante espectroscopia IR , RMN , métodos matemáticos, bioensayos, etc. [3] [4] [5]
Un buen ejemplo de escaneo de alanina es el examen del papel de los residuos cargados en la superficie de las proteínas. [6] En un estudio sistemático sobre los roles de los residuos cargados conservados en la superficie del canal de sodio epitelial ( ENaC ), se utilizó el escaneo de alanina para revelar la importancia de los residuos cargados para el proceso de transporte de las proteínas a la superficie celular. [6]
Aplicaciones
Se utilizó el escaneo de alanina para determinar simultáneamente las contribuciones funcionales de 19 cadenas laterales enterradas en la interfaz entre la hormona de crecimiento humana y el dominio extracelular de su receptor. [2] Cada aminoácido en las cadenas laterales fue sustituido por alanina. Luego se utilizó el método de escaneo shotgun que combina los conceptos de mutagénesis por escaneo de alanina y mutagénesis binomial con tecnología de visualización de fagos.
Otra aplicación crítica del escaneo de alanina es determinar la influencia de residuos individuales en la estructura y actividad en el ciclótido prototípico kalata B1. [3] Los ciclótidos muestran una amplia gama de bioactividades farmacéuticamente importantes, pero su función natural es la defensa de las plantas como agentes insecticidas. En la estructura de los ciclótidos kalata B1, los 23 residuos no cisteínicos fueron sustituidos sucesivamente con alanina. Los datos fueron probados por espectroscopia de RMN .
Además, el escaneo de alanina también se utiliza para determinar qué motivo funcional de Cry4Aa tiene la actividad mosquitocida. [4] Cry4Aa fue producida por Bacillus thuringiensis . Es una toxina específica de dípteros y juega un papel importante en cómo producir un bioinsecticida para controlar mosquitos. Por lo tanto, es muy esencial determinar qué motivo funcional de Cry4Aa contribuye a esta actividad. En este estudio, se crearon varios mutantes de Cry4Aa reemplazando los residuos del sitio de unión del receptor potencial, bucles 1, 2 y 3 en el dominio II con alanina. Se siguió un bioensayo Culex pipiens para probar las actividades.
Modelo de Alanina-Mundo
El método de escaneo de alanina aprovecha el hecho de que la mayoría de los aminoácidos canónicos pueden intercambiarse con Ala mediante mutaciones puntuales, mientras que la estructura secundaria de la proteína mutada permanece intacta, ya que Ala imita las preferencias de estructura secundaria de la mayoría de los aminoácidos codificados o canónicos. Esto lo predice el modelo Alanine-World .
Referencias
- ^ Morrison KL, Weiss GA (junio de 2001). "Escaneo combinatorio de alanina". Curr Opin Chem Biol . 5 (3): 302–7. doi :10.1016/S1367-5931(00)00206-4. PMID 11479122.
- ^ ab Weiss GA, Watanabe CK, Zhong A, Goddard A, Sidhu SS (agosto de 2000). "Mapeo rápido de epítopos funcionales de proteínas mediante escaneo combinatorio de alanina". Proc. Natl. Sci. EE. UU . . 97 (16): 8950–4. Bibcode :2000PNAS...97.8950W. doi : 10.1073/pnas.160252097 . PMC 16802 . PMID 10908667.
- ^ ab Simonsen SM, Sando L, Rosengren KJ, Wang CK, Colgrave ML, Daly NL, Craik DJ (abril de 2008). "La mutagénesis por escaneo de alanina del ciclótido prototípico revela un grupo de residuos esenciales para la bioactividad". J. Biol. Chem . 283 (15): 9805–13. doi : 10.1074/jbc.M709303200 . PMID 18258598.
- ^ ab Howlader MT, Kagawa Y, Miyakawa A, Yamamoto A, Taniguchi T, Hayakawa T, Sakai H (febrero de 2010). "Análisis de escaneo de alanina de los tres bucles principales en el dominio II de la toxina mosquitocida de Bacillus thuringiensis Cry4Aa". Appl. Environ. Microbiol . 76 (3): 860–5. Bibcode :2010ApEnM..76..860H. doi :10.1128/AEM.02175-09. PMC 2813026 . PMID 19948851.
- ^ Gauguin L, Delaine C, Alvino CL, McNeil KA, Wallace JC, Forbes BE, De Meyts P (julio de 2008). "Escaneo con alanina de una supuesta superficie de unión al receptor del factor de crecimiento similar a la insulina-I". J. Biol. Chem . 283 (30): 20821–9. doi : 10.1074/jbc.M802620200 . PMC 3258947. PMID 18502759 .
- ^ ab Edelheit O, Hanukoglu I, Dascal N, Hanukoglu A (abril de 2011). "Identificación de las funciones de los residuos cargados conservados en el dominio extracelular de una subunidad del canal de sodio epitelial (ENaC) mediante mutagénesis de alanina". Am. J. Physiol. Renal Physiol . 300 (4): F887–97. doi :10.1152/ajprenal.00648.2010. PMID 21209000. S2CID 869654.
Lectura adicional
- Michels CA (2002). Técnicas genéticas para la investigación biológica: un enfoque de estudio de caso . Londres: J. Wiley. p. 111. ISBN 978-0-471-89921-1.