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Articulo de referencia

escaneo de alanina

Ejemplo de análisis de mutagénesis por sustitución de alanina. Se considera la proteína nativa (fila superior) y cada posible mutación puntual a alanina. En biología molecular ,...

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Ejemplo de análisis de mutagénesis por sustitución de alanina. Se considera la proteína nativa (fila superior) y cada posible mutación puntual a alanina.

En biología molecular , el escaneo de alanina es una técnica de mutagénesis dirigida que se utiliza para determinar la contribución de un residuo específico a la estabilidad o función de una proteína determinada. [ 1 ] Se utiliza alanina debido a su grupo funcional metilo, que no es voluminoso ni químicamente inerte, pero que imita las preferencias de estructura secundaria que poseen muchos otros aminoácidos. En ocasiones, se utilizan aminoácidos voluminosos como la valina o la leucina cuando se requiere conservar el tamaño de los residuos mutados.

Esta técnica también puede utilizarse para determinar si la cadena lateral de un residuo específico desempeña un papel importante en la bioactividad . Esto se suele lograr mediante mutagénesis dirigida o aleatoriamente mediante la creación de una biblioteca de PCR . Además, se han desarrollado métodos computacionales para estimar parámetros termodinámicos basados ​​en sustituciones de alanina simuladas.

Esta técnica es rápida, ya que se analizan simultáneamente muchas cadenas laterales y se evita la necesidad de purificación de proteínas y análisis biofísicos. [ 2 ] La tecnología está muy madura en este punto y se utiliza ampliamente en campos bioquímicos. Los datos se pueden comprobar mediante espectroscopia IR , RMN , métodos matemáticos, bioensayos, etc. [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ]

Un buen ejemplo de escaneo de alanina es el examen del papel de los residuos cargados en la superficie de las proteínas. [ 6 ] En un estudio sistemático sobre las funciones de los residuos cargados conservados en la superficie del canal de sodio epitelial ( ENaC ), se utilizó el escaneo de alanina para revelar la importancia de los residuos cargados para el proceso de transporte de las proteínas a la superficie celular. [ 6 ]

Aplicaciones

Se utilizó el escaneo de alanina para determinar simultáneamente las contribuciones funcionales de 19 cadenas laterales enterradas en la interfaz entre la hormona del crecimiento humana y el dominio extracelular de su receptor. [ 2 ] Cada aminoácido en las cadenas laterales fue sustituido por alanina. Luego se utilizó el método de escaneo de escopeta, que combina los conceptos de mutagénesis por escaneo de alanina y mutagénesis binomial con la tecnología de visualización de fagos.

Another critical application of alanine scanning is to determine the influence of individual residues on structure and activity in the prototypic cyclotide kalata B1.[3] Cyclotides display a wide range of pharmaceutically important bioactivities, but their natural function is in plant defense as insecticidal agents. On the structure of cyclotides kalata B1, all 23 non-cysteine residues were successively substituted with alanine. The data were tested by NMR Spectroscopy.

In addition, alanine scanning is also used to determine which functional motif of Cry4Aa has the mosquitocidal activity.[4] Cry4Aa was produced by Bacillus thuringiensis. It is a dipteran-specific toxin and it plays an important role in how to produce a bioinsecticide to control mosquitoes. So, it is very essential to determine which functional motif of Cry4Aa contributes to this activity. In this study, several Cry4Aa mutants were made by replacing the residues of potential receptor binding site, loops 1, 2, and 3 in domain II with alanine. A bioassay Culex pipiens was followed to test the activities.

Alanine-World model

The alanine scanning method takes advantage of the fact that most canonical amino acids can be exchanged with Ala by point mutations, while the secondary structure of mutated protein remains intact, as Ala mimics the secondary structure preferences of the majority of the encoded or canonical amino acids. This is predicted by the Alanine-World model.

References

  1. ↑Morrison KL, Weiss GA (June 2001). "Combinatorial alanine-scanning". Curr Opin Chem Biol. 5 (3): 302–7. doi:10.1016/S1367-5931(00)00206-4. PMID 11479122.
  2. 12Weiss GA, Watanabe CK, Zhong A, Goddard A, Sidhu SS (August 2000). "Rapid mapping of protein functional epitopes by combinatorial alanine scanning". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (16): 8950–4. Bibcode:2000PNAS...97.8950W. doi:10.1073/pnas.160252097. PMC 16802. PMID 10908667.
  3. 1 2 Simonsen SM, Sando L, Rosengren KJ, Wang CK, Colgrave ML, Daly NL, Craik DJ (abril de 2008). "Mutagénesis por escaneo de alanina del ciclotido prototípico revela un grupo de residuos esenciales para la bioactividad" . J. Biol. Chem . 283 (15): 9805–13 . doi : 10.1074/jbc.M709303200 . PMID 18258598 . 
  4. 1 2 Howlader MT, Kagawa Y, Miyakawa A, Yamamoto A, Taniguchi T, Hayakawa T, Sakai H (febrero de 2010). "Análisis de escaneo de alanina de los tres bucles principales en el dominio II de la toxina mosquitocida Cry4Aa de Bacillus thuringiensis" . Appl . Environ. Microbiol . 76 (3): 860– 5. Bibcode : 2010ApEnM..76..860H . doi : 10.1128/AEM.02175-09 . PMC 2813026. PMID 19948851 .  
  5. ↑ Gauguin L, Delaine C, Alvino CL, McNeil KA, Wallace JC, Forbes BE, De Meyts P (julio de 2008). "Análisis de alanina de una supuesta superficie de unión al receptor del factor de crecimiento similar a la insulina I" . J. Biol. Chem . 283 (30): 20821–9 . doi : 10.1074/jbc.M802620200 . PMC 3258947. PMID 18502759 .  
  6. 1 2 Edelheit O, Hanukoglu I, Dascal N, Hanukoglu A (abril de 2011). "Identificación de las funciones de los residuos cargados conservados en el dominio extracelular de una subunidad del canal de sodio epitelial (ENaC) mediante mutagénesis con alanina". Am. J. Physiol. Renal Physiol . 300 (4): F887–97. doi : 10.1152/ajprenal.00648.2010 . PMID 21209000 . S2CID 869654 .  

Lecturas adicionales

  • Michels CA (2002). Técnicas genéticas para la investigación biológica: un estudio de caso . Londres: J. Wiley. pág.  111. ISBN 978-0-471-89921-1.