Oligonucleótido específico de alelo

Un oligonucleótido antisentido ( ASO ) es un fragmento corto de ADN sintético complementario a la secuencia de un ADN diana variable. Actúa como sonda para detectar la presencia de la diana en un ensayo de Southern blot o, más comúnmente, en el ensayo de dot blot, más sencillo . Es una herramienta habitual en pruebas genéticas , medicina forense e investigación en biología molecular .

Un ASO es típicamente un oligonucleótido de 15 a 21 bases de nucleótidos de longitud. Está diseñado (y utilizado) de manera que sea específico para solo una versión, o alelo , del ADN que se está analizando. ^{[ 1 ]} La longitud del ASO, la hebra de la que se elige y las condiciones en las que se une (y se lava) del ADN objetivo influyen en su especificidad. Estas sondas generalmente se pueden diseñar para detectar una diferencia de tan solo 1 base en la secuencia genética del objetivo, una capacidad básica en el ensayo de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), importante en el análisis de genotipos y el Proyecto Genoma Humano . Para ser detectado después de haberse unido a su objetivo, el ASO debe estar marcado con una etiqueta radiactiva, enzimática o fluorescente. La tecnología Illumina Methylation Assay aprovecha el ASO para detectar una diferencia de un par de bases (citosina frente a timina) para medir la metilación en un sitio CpG específico.

La anemia falciforme, una enfermedad humana , se produce por una mutación genética en el codón del sexto aminoácido de la proteína sanguínea beta-hemoglobina . La secuencia de ADN normal GAG codifica el aminoácido glutamato , mientras que la mutación cambia la adenina central por una timina , dando lugar a la secuencia GTG (GUG en el ARNm ). Esta secuencia alterada sustituye una valina en la proteína final, distorsionando su estructura.

Para detectar la presencia de la mutación en una muestra de ADN, se sintetizaría una sonda ASO complementaria a la secuencia alterada, ^{[ 2 ]} aquí denominada "S". Como control, se sintetizaría otra sonda ASO para la secuencia normal "A". Cada sonda ASO es totalmente complementaria a su secuencia diana (y se unirá fuertemente), pero presenta una única discrepancia con su alelo no diana (lo que resulta en una interacción más débil). El primer diagrama muestra cómo la sonda "S" es totalmente complementaria a la secuencia diana "S" (arriba), pero presenta una discrepancia parcial con la secuencia diana "A" (abajo).

Un segmento de los genes de la beta-hemoglobina en el ADN de la muestra se amplifica mediante PCR, y los productos resultantes se aplican a membranas de soporte duplicadas como Dot blots . Las hebras de ADN de la muestra se separan con álcali, y cada sonda ASO se aplica a una membrana diferente. Después de la hibridación, se utiliza un protocolo de lavado que permite distinguir entre los híbridos totalmente complementarios y los no complementarios. Los ASO no complementarios se eliminan de las membranas mediante lavado, mientras que los ASO complementarios (y sus etiquetas) permanecen.

En el segundo diagrama, se aplicaron seis muestras de ADN amplificado a cada una de las dos membranas. La detección de la etiqueta ASO que permanece después del lavado permite una lectura directa del genotipo de las muestras, cada una con dos copias del gen de la beta-hemoglobina. Las muestras 1 y 4 solo tienen el alelo "A" normal, mientras que las muestras 3 y 5 tienen ambos alelos, "A" y "S" (y, por lo tanto, son portadoras heterocigotas de esta mutación recesiva ). Las muestras 2 y 6 solo tienen el alelo "S" y estarían afectadas por la enfermedad. La pequeña cantidad de hibridación cruzada que se muestra es típica y se considera en el proceso de interpretación de los resultados finales.

El análisis ASO es solo uno de los métodos utilizados para detectar polimorfismos genéticos. La secuenciación directa de ADN se utiliza para caracterizar inicialmente la mutación, pero es demasiado laboriosa para el cribado rutinario. Un método anterior, el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), no necesitaba conocer el cambio de secuencia de antemano, pero requería que la mutación afectara el sitio de corte de una enzima de restricción . El ensayo RFLP se adaptó brevemente al uso de sondas de oligonucleótidos , ^{[ 3 ]} pero esta técnica fue rápidamente suplantada por el análisis ASO del ADN amplificado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La técnica PCR en sí misma se ha adaptado para detectar polimorfismos, como PCR alelo-específica . Sin embargo, la simplicidad y versatilidad del método combinado PCR/ASO ha llevado a su uso continuo, incluso con marcadores no radiactivos y en un formato de "punto inverso" donde las sondas ASO se unen a la membrana y el ADN de la muestra amplificado se utiliza para la hibridación .

El uso de oligonucleótidos sintéticos como sondas específicas para variaciones de secuencias genéticas fue iniciado por R. Bruce Wallace, quien trabajaba en el Centro Médico Nacional City of Hope en Duarte, California . En 1979, Wallace y sus colaboradores informaron sobre el uso de sondas ASO para detectar variaciones en un virus bacteriano monocatenario ^{[ 4 ]} , y posteriormente aplicaron la técnica a genes humanos clonados. En 1983 ^{[ 5 ]} y 1985 ^{[ 2 ],} el laboratorio de Wallace informó sobre la detección de la mutación de la anemia falciforme en muestras de ADN genómico completo, aunque esta aplicación se vio limitada por la pequeña cantidad de marcador que podía transportar el ASO ^{[ 2 ] .}

Afortunadamente, en 1985 también se describió la PCR, un método para amplificar considerablemente un segmento específico de ADN. ^{[ 3 ]} En menos de un año, la PCR se combinó con el análisis de ASO. ^{[ 6 ]} Esta combinación resolvió el problema del marcaje con ASO, ya que la cantidad de ADN diana podía amplificarse más de un millón de veces. Además, la especificidad del propio proceso de PCR se sumaba a la de las sondas ASO, reduciendo significativamente el problema de la unión inespecífica del ASO a secuencias no diana. La combinación era lo suficientemente específica como para utilizarse en un simple Dot blot , evitando el laborioso e ineficiente método de Southern blot .

La ASO-PCR también puede utilizarse para detectar enfermedad residual mínima en cánceres de la sangre como el mieloma múltiple . ^{[ 7 ]}

• Imagen del autorradiograma de ASO