Restricción de oligómeros

La restricción de oligómeros (abreviada como OR ) es un procedimiento para detectar una secuencia de ADN alterada en un genoma . Una sonda de oligonucleótidos marcada se hibrida con un ADN objetivo y luego se trata con una enzima de restricción . Si la sonda coincide exactamente con el objetivo, la enzima de restricción la escindirá, cambiando su tamaño. Sin embargo, si el ADN objetivo no coincide exactamente con la sonda, la enzima de restricción no tendrá efecto en la longitud de la sonda. La técnica OR, que ahora se realiza raramente, estuvo estrechamente asociada con el desarrollo del popular método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

En la parte 1a del esquema, la sonda de oligonucleótidos, marcada en su extremo izquierdo (asterisco), se muestra en la línea superior. Es totalmente complementaria a su ADN diana (aquí tomada del gen de la β-hemoglobina humana ), como se muestra en la línea siguiente. Parte de la sonda incluye el sitio de reconocimiento para la enzima de restricción Dde I (subrayado).

En la parte 1b, la enzima de restricción ha cortado la sonda y su diana (Dde I deja tres bases sin aparear en cada extremo). El extremo marcado de la sonda ahora tiene solo 8 bases de longitud y se separa fácilmente mediante electroforesis en gel de la sonda sin cortar, que tenía 40 bases de longitud.

En la segunda parte, se muestra la misma sonda hibridada con un ADN diana que incluye una mutación de una sola base (aquí, la mutación responsable de la anemia de células falciformes o SCA). El híbrido desapareado ya no actúa como un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción y la sonda conserva su longitud original.

La técnica de restricción de oligómeros se desarrolló como una variación del método de ensayo de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), con la esperanza de evitar el laborioso paso de transferencia Southern utilizado en el análisis RFLP. La OR fue concebida por Randall Saiki y Henry Erlich a principios de la década de 1980, trabajando en Cetus Corporation en Emeryville, California . Fue patentada en 1984 ^[1] y publicada en 1985, ^[2] habiéndose aplicado a la mutación genómica responsable de la anemia de células falciformes . La OR pronto fue reemplazada por la técnica más general de sondas de oligonucleótidos específicos de alelos (ASO). ^[3]

El método de restricción de oligómeros se vio afectado por una serie de problemas:

• Sólo se podía aplicar al pequeño conjunto de polimorfismos de ADN que alteraban un sitio de restricción, y sólo a aquellos sitios para los que se conocía la información de la secuencia. Muchos de los ensayos RFLP conocidos detectaron polimorfismos que estaban muy lejos de las ubicaciones de las sondas.
• Resulta difícil etiquetar oligonucleótidos a un nivel lo suficientemente alto como para utilizarlos como sondas de ADN genómico. Este problema también afectó al desarrollo de las sondas ASO.
• Es difícil diseñar oligonucleótidos y utilizarlos de manera que se conviertan en sondas de hibridación para un único sitio dentro de un genoma. La unión a lugares no específicos a menudo puede ocultar el efecto de la sonda en el lugar objetivo.
• No todas las enzimas de restricción tienen la especificidad deseada para su secuencia de reconocimiento. Algunas pueden reconocer y cortar ADN monocatenario, y otras muestran un bajo nivel de escisión para sitios no coincidentes. Incluso una pequeña cantidad de escisión no específica puede opacar la débil señal esperada de la secuencia objetivo.
• Fue difícil diseñar un método OR que incluyera controles para ambos alelos que se estaban probando. En la parte 2 del ejemplo simplificado descrito anteriormente, la sonda no se escindió cuando se hibridó con un objetivo mutante. Pero el mismo (no) resultado se produciría para el gran exceso de sonda no hibridada, así como si ocurriera algún problema que impidiera la digestión completa por la enzima de restricción. En el método real informado, ^[2] se utilizó un segundo sitio de restricción no polimórfico para cortar toda la sonda hibridada, y se utilizó un segundo oligonucleótido no marcado para "bloquear" la sonda no hibridada. Estos controles no habrían estado disponibles para otros objetivos.

A pesar de sus limitaciones, la técnica OR se benefició de su estrecha asociación con el desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa. Kary Mullis , que también trabajaba en Cetus, había sintetizado las sondas de oligonucleótidos que estaban probando Saiki y Erlich. Consciente de los problemas que estaban encontrando, imaginó un método alternativo para analizar la mutación SCA que utilizaría componentes de la técnica de secuenciación de ADN de Sanger . Al darse cuenta de la dificultad de hibridar un cebador de oligonucleótido en una única ubicación en el genoma, consideró utilizar un segundo cebador en la cadena opuesta. Luego generalizó ese proceso y se dio cuenta de que las extensiones repetidas de los dos cebadores conducirían a un aumento exponencial en el segmento de ADN entre los cebadores: una reacción en cadena de replicación catalizada por la ADN polimerasa . ^{[4] [5]}

Mullis se encontró con sus propias dificultades para demostrar la PCR , ^[6] por lo que se unió a un grupo de investigadores que ya existía y que estaban abordando los problemas de la OR. Juntos desarrollaron el ensayo combinado PCR-OR. De esta forma, la OR se convirtió en el primer método utilizado para analizar el ADN genómico amplificado por PCR.

Mullis también tuvo dificultades para publicar la idea básica de la PCR (las revistas científicas rara vez publican conceptos sin resultados que los acompañen). Cuando su manuscrito para la revista Nature fue rechazado, la descripción básica de la PCR se agregó apresuradamente al artículo originalmente destinado a informar sobre el método OR (Mullis también fue coautor allí). Este artículo OR ^[2] se convirtió así en la primera publicación de PCR y durante varios años se convertiría en el informe más citado por otros investigadores.