Prueba de Ames

La prueba de Ames es un método ampliamente utilizado que emplea bacterias para determinar si una sustancia química puede causar mutaciones en el ADN del organismo de prueba. Formalmente, se trata de un ensayo biológico para evaluar el potencial mutagénico de los compuestos químicos. ^{[ 1 ]} Un resultado positivo indica que la sustancia química es mutagénica y, por lo tanto, puede actuar como carcinógeno , ya que el cáncer suele estar relacionado con mutaciones . Esta prueba constituye un método rápido y práctico para estimar el potencial carcinogénico de un compuesto, dado que los ensayos estándar de carcinogenicidad en ratones y ratas son laboriosos (pueden tardar entre dos y tres años en completarse) y costosos. Sin embargo, se conocen casos de falsos positivos y falsos negativos. ^{[ 2 ]}

El procedimiento fue descrito en una serie de artículos a principios de la década de 1970 por Bruce Ames y su grupo en la Universidad de California, Berkeley . ^{[ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]}

La prueba de Ames utiliza varias cepas de la bacteria Salmonella typhimurium que presentan mutaciones en genes implicados en la biosíntesis de histidina . Estas cepas son mutantes auxótrofas , es decir, requieren histidina para crecer, pero no pueden producirla. El método evalúa la capacidad de la sustancia analizada para generar mutaciones que resulten en un retorno a un estado protótrofo, de modo que las células puedan crecer en un medio libre de histidina.

Las cepas de prueba están especialmente diseñadas para detectar mutaciones puntuales o de cambio de marco de lectura (p. ej., las cepas TA-1537 y TA-1538) en los genes necesarios para sintetizar histidina, de modo que se puedan identificar mutágenos que actúan mediante diferentes mecanismos. Algunos compuestos son bastante específicos y provocan reversiones en solo una o dos cepas. ^{[ 4 ]} Las cepas de prueba también presentan mutaciones en los genes responsables de la síntesis de lipopolisacáridos , lo que aumenta la permeabilidad de la pared celular bacteriana, ^{[ 5 ]} y en el sistema de reparación por escisión para aumentar la sensibilidad de la prueba. ^{[ 6 ]}

Los organismos más grandes, como los mamíferos, poseen procesos metabólicos que podrían transformar una sustancia química considerada no mutagénica en una mutagénica, o viceversa. ^{[ 7 ]} Por lo tanto, para evaluar con mayor eficacia la mutagenicidad de un compuesto químico en organismos más grandes, se pueden añadir enzimas hepáticas de rata para intentar replicar el efecto de los procesos metabólicos sobre el compuesto en la prueba de Ames. Opcionalmente, se añade extracto de hígado de rata para simular el efecto del metabolismo , ya que algunos compuestos, como el benzo[ a ]pireno , no son mutagénicos en sí mismos, pero sus productos metabólicos sí lo son. ^{[ 3 ]}

Las bacterias se siembran en una placa de agar con una pequeña cantidad de histidina. Esta pequeña cantidad de histidina en el medio de cultivo permite que las bacterias crezcan inicialmente y tengan la oportunidad de mutar. Cuando la histidina se agota, solo sobrevivirán las bacterias que hayan mutado y desarrollado la capacidad de producir su propia histidina. La placa se incuba durante 48 horas. La mutagenicidad de una sustancia es proporcional al número de colonias observadas.

Los mutágenos identificados mediante la prueba de Ames también son posibles carcinógenos, y los primeros estudios de Ames mostraron que el 90% de los carcinógenos conocidos pueden identificarse mediante esta prueba. ^{[ 8 ]} Sin embargo, estudios posteriores mostraron la identificación del 50-70% de los carcinógenos conocidos. La prueba se utilizó para identificar varios compuestos previamente utilizados en productos comerciales como posibles carcinógenos. ^{[ 9 ]} Algunos ejemplos incluyen el fosfato de tris(2,3-dibromopropilo) , que se utilizó como retardante de llama en plásticos y textiles como la ropa de dormir para niños, ^{[ 10 ]} y la furilfuramida , que se utilizó como aditivo antibacteriano en alimentos en Japón en las décadas de 1960 y 1970. De hecho, la furilfuramida había pasado previamente pruebas en animales, pero pruebas más rigurosas después de su identificación en la prueba de Ames demostraron que era carcinógena. ^{[ 11 ]} Sus pruebas positivas dieron como resultado que esos químicos fueran retirados del uso de productos de consumo.

Un resultado interesante de la prueba de Ames es que la curva dosis-respuesta utilizando concentraciones variables del químico es casi siempre lineal, ^{[ 8 ]} lo que indica que no hay una concentración umbral para la mutagénesis. Por lo tanto, sugiere que, como con la radiación, puede que no haya un umbral seguro para los mutágenos o carcinógenos químicos. ^{[ 12 ] [ 13 ]} Sin embargo, algunos han propuesto que los organismos podrían tolerar niveles bajos de mutágenos debido a mecanismos de protección como la reparación del ADN , y por lo tanto, puede existir un umbral para ciertos mutágenos químicos. ^{[ 14 ]} El propio Bruce Ames argumentó en contra de la extrapolación lineal de la dosis-respuesta desde la dosis alta utilizada en las pruebas de carcinogénesis en sistemas animales a la dosis más baja de químicos que normalmente se encuentran en la exposición humana, ya que los resultados pueden ser falsos positivos debido a la respuesta mitogénica causada por la dosis artificialmente alta de químicos utilizada en dichas pruebas. ^{[ 15 ] [ 16 ]} También advirtió contra la "histeria por trazas minúsculas de químicos que pueden o no causar cáncer", que "eclipsa por completo los principales riesgos que se deben conocer". ^{[ 17 ]}

La prueba de Ames se utiliza a menudo como una de las pruebas iniciales para detectar posibles fármacos y descartar posibles carcinógenos. Es una de las ocho pruebas requeridas por la Ley de Plaguicidas (EE. UU.) y una de las seis pruebas requeridas por la Ley de Control de Sustancias Tóxicas (EE. UU.). ^{[ 18 ]}

Salmonella typhimurium es un procariota, por lo tanto no es un modelo perfecto para los humanos. La fracción S9 del hígado de rata se utiliza para imitar las condiciones metabólicas de los mamíferos para que se pueda evaluar el potencial mutagénico de los metabolitos formados por una molécula parental en el sistema hepático; sin embargo, existen diferencias en el metabolismo entre humanos y ratas que pueden afectar la mutagenicidad de los químicos que se están probando. ^{[ 19 ]} Por lo tanto, la prueba puede mejorarse mediante el uso de la fracción S9 del hígado humano; su uso estaba anteriormente limitado por su disponibilidad, pero ahora está disponible comercialmente y por lo tanto puede ser más factible. ^{[ 20 ]} Se ha hecho un modelo in vitro adaptado para células eucariotas, por ejemplo, levadura.

Los mutágenos identificados en la prueba de Ames no necesariamente son carcinógenos, y se requieren pruebas adicionales para cualquier posible carcinógeno detectado. Algunos fármacos que contienen el grupo nitrato dan positivo en la prueba de Ames, aunque sean seguros. Los compuestos de nitrato pueden generar óxido nítrico , una molécula señal importante que puede dar un falso positivo. La nitroglicerina es un ejemplo que da positivo en la prueba de Ames y que aún se utiliza en tratamientos. Sin embargo, los nitratos presentes en los alimentos pueden ser reducidos por la acción bacteriana a nitritos, los cuales se sabe que generan carcinógenos al reaccionar con aminas y amidas . Se necesitan estudios toxicológicos y de resultados a largo plazo con estos compuestos para descartar un resultado positivo en la prueba de Ames.

La prueba de Ames se desarrolló inicialmente utilizando placas de agar (técnica de incorporación en placa), como se describió anteriormente. Desde entonces, se ha desarrollado una alternativa para realizar la prueba de Ames, conocida como el "método de fluctuación". Esta técnica es conceptualmente similar al método basado en agar, donde se añaden bacterias a una mezcla de reacción con una pequeña cantidad de histidina , lo que permite que las bacterias crezcan y muten, volviendo a sintetizar su propia histidina. Al incluir un indicador de pH , la frecuencia de mutación se cuenta en microplacas como el número de pocillos que han cambiado de color (debido a una disminución del pH causada por los procesos metabólicos de las bacterias en reproducción). Al igual que con la prueba de Ames tradicional, la muestra se compara con la tasa natural de mutación inversa para establecer la genotoxicidad de una sustancia. El método de fluctuación se realiza completamente en cultivo líquido y se evalúa contando el número de pocillos que cambian de color de púrpura a amarillo en microplacas de 96 o 384 pocillos.

En el método de placas de 96 pocillos, la frecuencia de mutación se calcula contando el número de pocillos de un total de 96 que han cambiado de color. Las placas se incuban durante un máximo de cinco días, contando diariamente las colonias mutadas (amarillas) y comparándolas con la tasa de mutación inversa de fondo mediante tablas de significancia establecidas para determinar las diferencias significativas entre la tasa de mutación de fondo y la de las muestras analizadas.

En el método de microfluctuación en placas de 384 pocillos, a menor escala, la frecuencia de mutación se calcula contando el número de pocillos (de un total de 48) que han cambiado de color tras dos días de incubación. Se analiza una muestra en seis niveles de dosis, con controles positivos y de dosis cero (fondo) simultáneos, todos ellos en una placa de 384 pocillos. El ensayo se realiza por triplicado para garantizar la solidez estadística. Se utilizan las cepas de prueba recomendadas en la Guía 471 de la OCDE (auxótrofas de histidina y auxótrofas de triptófano ).

El método de fluctuación es comparable al método tradicional de siembra en placa en términos de sensibilidad y precisión; sin embargo, presenta varias ventajas: requiere menos muestra, tiene un punto final colorimétrico simple y contar el número de pocillos positivos de entre 96 o 48 pocillos posibles es mucho menos laborioso que contar colonias individuales en una placa de agar. Existen varios kits comerciales disponibles. La mayoría de los kits incluyen componentes consumibles listos para usar, como bacterias liofilizadas, y las pruebas pueden realizarse con pipetas multicanal. El método de fluctuación también permite analizar mayores volúmenes de muestras acuosas (hasta un 75 % v/v), lo que aumenta la sensibilidad y amplía su aplicación a mutágenos ambientales de baja concentración. ^{[ 21 ]}