Análisis de restricción del ADN ribosómico amplificado

El análisis de restricción del ADN ribosómico (ADNr) amplificado es una extensión de la técnica RFLP ( polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción ) al gen que codifica la subunidad ribosómica pequeña (16S) de las bacterias . La técnica implica una amplificación enzimática utilizando cebadores dirigidos a las regiones conservadas en los extremos del gen 16S, seguida de una digestión con enzimas de restricción tetracutter . Se dice que el patrón obtenido es representativo de la especie analizada. Los patrones obtenidos con varias enzimas de restricción pueden utilizarse para caracterizar filogenéticamente aislados cultivados y genes 16S obtenidos mediante clonación a partir de ADN de la comunidad ^{[ 1 ].}

Vaneechoutte et al. , ^{[ 2 ]} fueron de los primeros en utilizar este método y lo aplicaron para caracterizar especies de Mycobacterium y Acinetobacter ^{[ 3 ]} Numerosos otros estudios han aplicado ARDRA para diferentes taxones bacterianos. Debido a que se dirige al gen ribosomal 16s comparativamente conservado, ARDRA es rápido y rentable para comparar huellas dactilares de comunidades, pero su poder discriminatorio es limitado y pueden ser necesarias múltiples enzimas de restricción para obtener una resolución adecuada. ^{[ 4 ] [ 5 ]} Basado en la fórmula simple para la frecuencia de ocurrencia aleatoria de un sitio de restricción, una secuencia de 4 pb puede ocurrir una vez cada 256 pb. Una enzima de restricción que tenga un sitio de reconocimiento de más de 4 pb sería irrelevante con respecto a un gen de aproximadamente 1500 pb como el que codifica para la subunidad ribosomal 16s. Varias enzimas de restricción tetracutter están disponibles en el mercado. Para garantizar la significación estadística, se deben utilizar al menos tres enzimas de restricción en el análisis para superar la probabilidad de que ciertas enzimas de restricción produzcan patrones similares en organismos que no están tan alejados entre sí.

El amplicón que se va a analizar debe tener preferiblemente un tamaño superior a 1000 pb, simplemente para aumentar la probabilidad de encontrar el sitio de restricción . Los amplicones deben purificarse preferiblemente antes de la digestión. Esto se puede hacer con numerosos kits de purificación disponibles comercialmente. Se debe tener cuidado al elegir las enzimas de restricción. Algunas enzimas de restricción reconocen los mismos sitios y no pueden contribuir productivamente al análisis.  Se recomienda una digestión nocturna (10-16 horas) de aproximadamente 300-500 ng de ADN del amplicón en un sistema de 20 μL con 4-5 unidades de enzima de restricción junto con el tampón recomendado a la temperatura prescrita. Después de la digestión, se detiene la reacción y se realiza la electroforesis en un gel de agarosa al 2-3% a 90-100 V. El gel debe tener una longitud que permita una resolución adecuada de los fragmentos menores, de tan solo 100-200 pb.

El análisis de los patrones se realiza con métodos utilizados para patrones RAPD . Los grupos de bacterias relacionadas pueden representarse en forma de cladograma o filograma . Después del análisis inicial, un programa de análisis multivariante como NT-SYS ^{[ 6 ]} o PAST ^{[ 7 ]} proporciona detalles sobre la presencia o ausencia de bandas, marcadas como 1 (para presencia) y 0 (para ausencia). Los datos pueden utilizarse posteriormente para generar un filograma o cladograma . La tabla de datos puede utilizarse para trazar un árbol filogenético que indicaría la relación de los organismos en función del patrón de restricción obtenido de sus respectivos genes 16s. También hay software comercial disponible para el análisis de estos patrones; los más utilizados son los paquetes GelCompar II y BioNumerics .