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pistola genética

Sistema de administración de partículas PDS-1000/He En ingeniería genética , un arma génica o sistema de administración de partículas biolísticas es un dispositivo que se utiliz...

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Sistema de administración de partículas PDS-1000/He

En ingeniería genética , un arma génica o sistema de administración de partículas biolísticas es un dispositivo que se utiliza para introducir ADN exógeno ( transgenes ), ARN o proteínas en las células. Al recubrir partículas de un metal pesado con un gen de interés y disparar estos microproyectiles contra las células mediante fuerza mecánica, se puede introducir la información genética deseada en las células objetivo. La técnica que implica la administración de ADN mediante microproyectiles se conoce comúnmente como biolística , abreviatura de "balística biológica". [ 1 ] [ 2 ]

Este dispositivo es capaz de transformar casi cualquier tipo de célula y no se limita a la transformación del núcleo; también puede transformar orgánulos, incluidos plastidios y mitocondrias . [ 3 ]

Se utiliza una pistola génica para introducir ADN exógeno en las células. Este método se conoce como «biobalística». Las pistolas génicas pueden utilizarse eficazmente en la mayoría de las células, pero se emplean principalmente en células vegetales.
  1. El aparato de la pistola genética está listo para disparar.
  2. El helio llena la cámara y la presión aumenta contra el disco de ruptura.
  3. Finalmente, la presión alcanza el punto en el que el disco de ruptura se rompe, y la consiguiente explosión de helio impulsa el macroportador recubierto de ADN/oro ("disco de plástico") hacia la rejilla de detención.
  4. Cuando el macroportador choca con la rejilla de detención, las partículas de oro recubiertas de ADN son impulsadas a través de la rejilla y hacia las células objetivo.

diseño de pistola genética

La pistola genética era originalmente una pistola de aire comprimido Crosman modificada para disparar partículas densas de tungsteno . Fue inventada por John C. Sanford , Ed Wolf y Nelson Allen en la Universidad de Cornell [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] junto con Ted Klein de DuPont entre 1983 y 1986. El objetivo original eran las cebollas (elegidas por el gran tamaño de sus células), y el dispositivo se utilizaba para administrar partículas recubiertas con un gen marcador que transmitiría una señal si se producía la inserción correcta del transcrito de ADN. [ 7 ] La ​​transformación genética se demostró al observar la expresión del gen marcador dentro de las células de cebolla.

Las primeras pistolas genéticas de fabricación personalizada (fabricadas por Nelson Allen) utilizaban un cartucho de pistola de clavos calibre 22 para impulsar un cilindro de polietileno (bala) a través de un cañón Douglas calibre 22. Una gota de polvo de tungsteno recubierto con material genético se colocaba sobre la bala y se disparaba hacia una placa de Petri situada debajo. La bala se adhería al disco debajo de la placa de Petri, y el material genético se inyectaba en la muestra con un efecto de anillo, causando devastación en el centro y una transformación positiva en la periferia. La pistola estaba conectada a una bomba de vacío y se mantenía al vacío durante el disparo. El diseño inicial fue producido en serie de forma limitada por Rumsey-Loomis (un taller mecánico local ubicado entonces en Mecklenburg Road, Ithaca, NY, EE. UU.).

Biolistics, Inc. vendió a Dupont los derechos para fabricar y distribuir un dispositivo actualizado con mejoras que incluyen el uso de helio como propulsor no explosivo y un mecanismo de entrega por colisión de discos múltiples para minimizar el daño a los tejidos de la muestra. También se utilizan otros metales pesados ​​como el oro y la plata para administrar material genético, siendo el oro el preferido debido a su menor citotoxicidad en comparación con los proyectiles portadores de tungsteno. [ 8 ]

Diseño de construcciones biolísticas

La transformación biolística implica la integración de un fragmento funcional de ADN —conocido como constructo de ADN— en las células diana. Un constructo genético es una secuencia de ADN que contiene todos los elementos reguladores necesarios para su correcta expresión en el organismo diana. [ 9 ] Si bien los constructos genéticos pueden variar en su diseño según el resultado deseado del procedimiento de transformación, todos suelen contener una combinación de una secuencia promotora , una secuencia terminadora , el gen de interés y un gen reportero .

Promotor
Los promotores controlan la localización y la magnitud de la expresión génica y funcionan como el "volante y el acelerador" de un gen. [ 9 ] Los promotores preceden al gen de interés en la construcción de ADN y pueden modificarse mediante diseño de laboratorio para ajustar con precisión la expresión del transgén. El promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor es un ejemplo de un promotor de uso común que da como resultado una expresión génica constitutiva robusta en las plantas. [ 10 ]
Terminator
Las secuencias terminadoras son necesarias para la correcta expresión génica y se colocan después de la región codificante del gen de interés dentro del constructo de ADN. Un terminador común para la transformación biolística es el terminador NOS derivado de Agrobacterium tumefaciens . Debido a la alta frecuencia de uso de este terminador en plantas genéticamente modificadas, se han desarrollado estrategias para detectar su presencia en la cadena alimentaria y así controlar los cultivos transgénicos no autorizados. [ 11 ]
Gen reportero
Un gen que codifica un marcador seleccionable es un elemento común en las construcciones de ADN y se utiliza para seleccionar células transformadas correctamente. El marcador seleccionable elegido dependerá de la especie que se esté transformando, pero normalmente será un gen que confiere a las células capacidad de desintoxicación para ciertos herbicidas o antibióticos como la kanamicina , la higromicina B o el glifosato [ 9 ] . [ 12 ] [ 13 ] [ 14 ]
Elementos adicionales
Los componentes opcionales de una construcción de ADN incluyen elementos como las secuencias cre-lox que permiten la eliminación controlada de la construcción del genoma objetivo. [ 15 ] Dichos elementos son seleccionados por el desarrollador de la construcción para realizar funciones especializadas junto con el gen principal de interés.

Solicitud

Las pistolas genéticas se utilizan principalmente con células vegetales. Sin embargo, también tienen un gran potencial de uso en humanos y otros animales.

Plantas

El objetivo de una pistola génica suele ser un callo de células vegetales indiferenciadas o un grupo de embriones inmaduros que crecen en un medio de cultivo en gel en una placa de Petri. Una vez que las partículas de oro recubiertas de ADN se han introducido en las células, el ADN se utiliza como plantilla para la transcripción (expresión transitoria) y, en ocasiones, se integra en un cromosoma vegetal (transformación estable).

Si el ADN insertado contiene un marcador seleccionable, se pueden seleccionar y cultivar células transformadas de forma estable mediante métodos de cultivo celular. Por ejemplo, si el ADN insertado contiene un gen que confiere resistencia a un antibiótico o herbicida, se pueden seleccionar células transformadas de forma estable añadiendo dicho antibiótico o herbicida al medio de cultivo.

Las células transformadas pueden tratarse con una serie de hormonas vegetales, como auxinas y giberelinas , y cada una puede dividirse y diferenciarse en las células tisulares especializadas y organizadas de una planta completa. Esta capacidad de regeneración total se denomina totipotencia . La nueva planta que se origina a partir de una célula transformada con éxito puede presentar nuevos rasgos hereditarios. El uso de la pistola génica se puede contrastar con el uso de Agrobacterium tumefaciens y su plásmido Ti para insertar ADN en células vegetales. Véase transformación para conocer diferentes métodos de transformación en distintas especies.

Los humanos y otros animales

Las pistolas genéticas también se han utilizado para administrar vacunas de ADN .

La introducción de plásmidos en neuronas de rata mediante el uso de una pistola génica, específicamente en neuronas de los ganglios de la raíz dorsal (DRG), también se utiliza como precursor farmacológico en el estudio de los efectos de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer .

La pistola génica se ha convertido en una herramienta común para marcar subconjuntos de células en tejidos cultivados. Además de poder transfectar células con plásmidos de ADN que codifican proteínas fluorescentes, la pistola génica puede adaptarse para administrar una amplia variedad de colorantes vitales a las células. [ 16 ]

El bombardeo con pistola genética también se ha utilizado para transformar Caenorhabditis elegans , como alternativa a la microinyección . [ 17 ]

Ventajas

La biobalística ha demostrado ser un método versátil de modificación genética y generalmente se prefiere para diseñar cultivos resistentes a la transformación, como los cereales . Cabe destacar que el maíz Bt es un producto de la biobalística. [ 9 ] La transformación de plastidios también ha tenido un gran éxito con el bombardeo de partículas en comparación con otras técnicas actuales, como la transformación mediada por Agrobacterium , que tienen dificultades para dirigir el vector al cloroplasto y expresarlo de forma estable en él. [ 9 ] [ 18 ] Además, no hay informes de un cloroplasto que silencie un transgén insertado con un cañón de genes. [ 19 ] Adicionalmente, con un solo disparo de un cañón de genes, un técnico experto puede generar dos organismos transformados en ciertas especies. [ 18 ] Esta tecnología incluso ha permitido la modificación de tejidos específicos in situ , aunque es probable que esto dañe un gran número de células y transforme solo algunas , en lugar de todas, las células del tejido. [ 20 ]

Limitaciones

La biolística introduce ADN aleatoriamente en las células diana. Por lo tanto, el ADN puede transformarse en cualquier genoma presente en la célula, ya sea nuclear, mitocondrial, plasmídico o cualquier otro, en cualquier combinación, aunque un diseño adecuado del constructo puede mitigar esto. La entrega e integración de múltiples plantillas del constructo de ADN es una posibilidad clara, lo que resulta en niveles de expresión y números de copias variables del gen insertado. [ 9 ] Esto se debe a la capacidad de los constructos para dar y recibir material genético de otros constructos, lo que hace que algunos no porten ningún transgén y otros porten múltiples copias; el número de copias insertadas depende tanto de cuántas copias del transgén tiene un constructo insertado como de cuántas se insertaron. [ 9 ] Además, debido a que los constructos eucariotas dependen de la recombinación ilegítima —un proceso por el cual el transgén se integra en el genoma sin secuencias genéticas similares— y no de la recombinación homóloga , no pueden dirigirse a ubicaciones específicas dentro del genoma, [ 9 ] a menos que el transgén se entregue junto con reactivos de edición genómica .

Referencias

  1. ↑ O'Brien, John A.; Lummis, Sarah CR (2011). "Nanobiolística: un método de transfección biolística de células y tejidos mediante una pistola génica con proyectiles novedosos de tamaño nanométrico" . BMC Biotechnology . 11 66. doi : 10.1186/1472-6750-11-66 . PMC 3144454. PMID 21663596 .  
  2. ↑ Carter, Matt; Shieh, Jennifer (6 de marzo de 2015). «Estrategias de administración de genes». Guía de técnicas de investigación en neurociencia (segunda edición). Academic Press. ISBN  978-0-12-800511-8.
  3. ↑ Sanford, John C. (1990). "Transformación biolística de plantas". Physiologia Plantarum . 79 (1): 206– 209. Bibcode : 1990PPlan..79..206S . doi : 10.1111/j.1399-3054.1990.tb05888.x . ISSN 1399-3054 . 
  4. ↑ Segelken, Roger (14 de mayo de 1987). "Biólogo inventa arma para disparar a células con ADN" (PDF) . Cornell Chronicle . pág. 3. Archivado del original (PDF) el 29 de octubre de 2013. Recuperado el 5 de junio de 2014 . 
  5. ↑ Sanford, JC; Klein, TM; Wolf, ED; Allen, N. (1987). "Administración de sustancias a células y tejidos mediante un proceso de bombardeo de partículas". Particulate Science and Technology . 5 (1): 27– 37. doi : 10.1080/02726358708904533 .
  6. ↑ Klein, TM; Wolf, ED; Wu, R.; Sanford, JC (mayo de 1987). "Microproyectiles de alta velocidad para la administración de ácidos nucleicos en células vivas". Nature . 327 (6117): 70– 73. Bibcode : 1987Natur.327...70K . doi : 10.1038/327070a0 . S2CID 4265777 . 
  7. ↑ Segelken, Roger. "The Gene Shotgun" . Facultad de Agricultura y Ciencias de la Vida de la Universidad de Cornell. Archivado del original el 26 de abril de 2010. Recuperado el 5 de junio de 2014 .
  8. ↑ Russell, Julie A.; Roy, Mihir K.; Sanford, John C. (1992-03-01). "El trauma físico y la toxicidad del tungsteno reducen la eficiencia de la transformación biolística" . Plant Physiology . 98 (3): 1050– 1056. doi : 10.1104/pp.98.3.1050 . ISSN 0032-0889 . PMC 1080307. PMID 16668726 .   
  9. 1 2 3 4 5 6 7 8 Slater, Adrian; Scott, Nigel; Fowler, Mark (2008). Biotecnología vegetal: la manipulación genética de las plantas (2.ª ed.). Oxford, Nueva York, EE. UU.: Oxford University Press Inc. ISBN  978-0-19-928261-6.
  10. ↑ Benfey, PN; Chua, N.-H. (1990-11-16). "El promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor: regulación combinatoria de la transcripción en plantas". Science . 250 (4983): 959– 966. Bibcode : 1990Sci...250..959B . doi : 10.1126/science.250.4983.959 . ISSN 0036-8075 . PMID 17746920 . S2CID 35471862 .   
  11. ↑ "Terminador de la sintasa de nopalina: Temas de Science.gov" . www.science.gov . Consultado el 20 de noviembre de 2019 .
  12. ↑ Norris, MH; Kang, Y.; Lu, D.; Wilcox, BA; Hoang, TT (2009-07-31). "Resistencia al glifosato como un nuevo marcador seleccionable no apto para agentes selectivos y no apto para antibióticos en la mutagénesis cromosómica de los genes esenciales asd y dapB de Burkholderia pseudomallei" . Microbiología Aplicada y Ambiental . 75 (19): 6062– 6075. Bibcode : 2009ApEnM..75.6062N . doi : 10.1128/aem.00820-09 . ISSN 0099-2240 . PMC 2753064. PMID 19648360 .   
  13. ↑ Blochlinger, K; Diggelmann, H (diciembre de 1984). "La fosfotransferasa de higromicina B como marcador seleccionable para experimentos de transferencia de ADN con células eucariotas superiores" . Biología molecular y celular . 4 (12): 2929– 2931. doi : 10.1128/mcb.4.12.2929 . ISSN 0270-7306 . PMC 369308. PMID 6098829 .   
  14. ↑ Carrer, Helaine; Hockenberry, Tish Noel; Svab, Zora; Maliga, Pal (octubre de 1993). "Resistencia a la kanamicina como marcador seleccionable para la transformación de plastidios en tabaco". MGG Molecular & General Genetics . 241–241 ( 1–2 ): 49–56 . doi : 10.1007/bf00280200 . ISSN 0026-8925 . PMID 8232211. S2CID 2291268 .   
  15. ↑ Gilbertson, Larry (diciembre de 2003). "Recombinación Cre-lox: herramientas creativas para la biotecnología vegetal". Trends in Biotechnology . 21 (12): 550– 555. doi : 10.1016/j.tibtech.2003.09.011 . ISSN 0167-7799 . PMID 14624864 .  
  16. ↑ Gan, Wen-Biao; Grutzendler, Jaime; Wong, Wai Thong; Wong, Rachel OL ; Lichtman, Jeff W (2000). "Marcaje multicolor "Diolistic" del sistema nervioso mediante combinaciones de colorantes lipofílicos" . Neuron . 27 ( 2): 219–25 . doi : 10.1016/S0896-6273(00)00031-3 . PMID 10985343. S2CID 16962732 .  
  17. ↑ Praitis, Vida (2006). "Creación de líneas transgénicas mediante métodos de bombardeo de micropartículas". C. elegans . Methods in Molecular Biology. Vol. 351. pp. 93–108 . doi : 10.1385/1-59745-151-7:93 . ISBN   978-1-59745-151-2. PMID 16988428 . 
  18. 1 2 Sanford, John (28 de abril de 2006). "Transformación biolística de plantas". Physiologia Plantarum . 79 (1): 206– 209. Bibcode : 1990PPlan..79..206S . doi : 10.1111/j.1399-3054.1990.tb05888.x .
  19. ↑ Kikkert, Julie; Vidal, Jose; Reisch, Bruce (2005). "Transformación estable de células vegetales mediante bombardeo de partículas/biolística". Plantas transgénicas . Métodos en biología molecular. Vol. 286. pp. 61–78 . doi : 10.1385/1-59259-827-7:061 . ISBN   978-1-59259-827-4. PMID 15310913 . S2CID 44395352 .  
  20. ↑ Hayward, MD; Bosemark, NO; Romagosa, T. (2012). Mejora genética de plantas: principios y perspectivas . Springer Science & Business Media. pág. 131. ISBN  9789401115247.

Lecturas adicionales

  • O'Brien, J; Holt, M; Whiteside, G; Lummis, SC; Hastings, MH (2001). "Modificaciones al Gene Gun portátil: mejoras para la transfección biolística in vitro de tejido neuronal organotípico" . Journal of Neuroscience Methods . 112 (1): 57– 64. doi : 10.1016/S0165-0270(01)00457-5 . PMID 11640958. S2CID 30561105 .  
  • John O'Brien presenta... Gene Gun Barrels para obtener más información sobre biolística.