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vacuna de ADN

La elaboración de una vacuna de ADN Una vacuna de ADN es un tipo de vacuna que transfecta una secuencia de ADN específica que codifica un antígeno en las células de un organismo...

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La elaboración de una vacuna de ADN

Una vacuna de ADN es un tipo de vacuna que transfecta una secuencia de ADN específica que codifica un antígeno en las células de un organismo como mecanismo para inducir una respuesta inmune. [ 1 ] [ 2 ]

Las vacunas de ADN funcionan inyectando un plásmido modificado genéticamente que contiene la secuencia de ADN que codifica el/los antígeno (s) contra el/los cual(es) se busca una respuesta inmune, de modo que las células producen directamente el antígeno, causando así una respuesta inmunológica protectora . [ 3 ] Las vacunas de ADN tienen ventajas teóricas sobre las vacunas convencionales, incluyendo la "capacidad de inducir una gama más amplia de tipos de respuesta inmune". [ 4 ] Varias vacunas de ADN se han probado para uso veterinario . [ 3 ] En algunos casos, se ha obtenido protección contra la enfermedad en animales, en otros no. [ 3 ] La investigación continúa sobre el enfoque para enfermedades virales, bacterianas y parasitarias en humanos, así como para cánceres. [ 4 ] En agosto de 2021, las autoridades indias dieron aprobación de emergencia a ZyCoV-D . Desarrollada por Cadila Healthcare , es la primera vacuna de ADN aprobada para humanos. [ 5 ]

Historia

Las vacunas convencionales contienen antígenos específicos de un patógeno o virus atenuados que estimulan una respuesta inmunitaria en el organismo vacunado. Las vacunas de ADN pertenecen al grupo de las vacunas genéticas , ya que contienen información genética (ADN o ARN) que codifica la producción celular ( biosíntesis de proteínas ) de un antígeno . Estas vacunas contienen ADN que codifica antígenos específicos de un patógeno. El ADN se inyecta en el cuerpo y es absorbido por las células, cuyos procesos metabólicos normales sintetizan proteínas basadas en el código genético del plásmido que han incorporado. Dado que estas proteínas contienen regiones de secuencias de aminoácidos características de bacterias o virus, son reconocidas como extrañas y, cuando las células huésped las procesan y las muestran en su superficie, el sistema inmunitario se activa, lo que desencadena respuestas inmunitarias. [ 6 ] [ 7 ] Alternativamente, el ADN puede encapsularse en una proteína para facilitar su entrada en la célula. Si esta proteína de la cápside se incluye en el ADN, la vacuna resultante puede combinar la potencia de una vacuna viva sin riesgos de reversión.

En 1983, Enzo Paoletti y Dennis Panicali del Departamento de Salud de Nueva York idearon una estrategia para producir vacunas de ADN recombinante utilizando ingeniería genética para transformar la vacuna común contra la viruela en vacunas que podrían prevenir otras enfermedades. [ 8 ] Alteraron el ADN del virus de la viruela bovina insertando un gen de otros virus (a saber, el virus del herpes simple , la hepatitis B y la influenza ). [ 9 ] [ 10 ] En 1993, Jeffrey Ulmer y sus colaboradores en los Laboratorios de Investigación Merck demostraron que la inyección directa de ratones con ADN plasmídico que codificaba un antígeno de la gripe protegía a los animales contra la infección experimental posterior con el virus de la influenza. [ 11 ] En 2016, una vacuna de ADN para el virus Zika comenzó a probarse en humanos en los Institutos Nacionales de Salud . El estudio estaba planeado para involucrar hasta 120 sujetos de entre 18 y 35 años. Por separado, Inovio Pharmaceuticals y GeneOne Life Science comenzaron las pruebas de una vacuna de ADN diferente contra el Zika en Miami. La vacuna del NIH se inyecta en la parte superior del brazo a alta presión. La fabricación de las vacunas en grandes cantidades seguía sin resolverse en agosto de 2016. [ 12 ] Se están llevando a cabo ensayos clínicos de vacunas de ADN para prevenir el VIH. [ 13 ]

En agosto de 2021, las autoridades indias dieron la aprobación de emergencia a ZyCoV-D. Desarrollada por Cadila Healthcare , es la primera vacuna de ADN contra la COVID-19 . [ 5 ]

Aplicaciones

A partir de 2021En Estados Unidos no se ha aprobado ninguna vacuna de ADN para uso humano. Pocos ensayos experimentales han logrado una respuesta lo suficientemente fuerte como para proteger contra la enfermedad, y la utilidad de esta técnica aún debe comprobarse en humanos.

Se ha aprobado una vacuna veterinaria de ADN para proteger a los caballos del virus del Nilo Occidental. [ 14 ] Otra vacuna contra el virus del Nilo Occidental se ha probado con éxito en petirrojos americanos. [ 15 ]

La inmunización con ADN también se está investigando como un medio para desarrollar sueros antiveneno. [ 1 ] La inmunización con ADN puede utilizarse como plataforma tecnológica para la inducción de anticuerpos monoclonales. [ 2 ]

Ventajas

  • Sin riesgo de infecciones [ 7 ]
  • Presentación de antígenos por moléculas MHC de clase I y clase II [ 7 ]
  • Polarizar la respuesta de las células T hacia el tipo 1 o el tipo 2 [ 7 ]
  • Respuesta inmune centrada en el antígeno de interés.
  • Facilidad de desarrollo y producción [ 7 ]
  • Estabilidad para almacenamiento y envío
  • Rentabilidad
  • Evita la necesidad de síntesis de péptidos, expresión y purificación de proteínas recombinantes y el uso de adyuvantes tóxicos [ 16 ].
  • Persistencia a largo plazo del inmunógeno [ 6 ]
  • La expresión in vivo garantiza que la proteína se asemeje más a la estructura eucariota normal, con las modificaciones postraduccionales correspondientes [ 6 ].

Desventajas

  • Limitado a inmunógenos proteicos (no útil para antígenos no proteicos como los polisacáridos bacterianos).
  • Potencial para el procesamiento atípico de proteínas bacterianas y parasitarias [ 7 ]
  • Potencial al usar la administración de nanopartículas de ADN plasmídico mediante aerosol nasal para transfectar células no objetivo, como células cerebrales [ 17 ].
  • Contaminación cruzada al fabricar diferentes tipos de vacunas vivas en la misma instalación.

Vectores plasmídicos

Diseño vectorial

Las vacunas de ADN inducen la mejor respuesta inmune cuando se utilizan vectores de alta expresión. Estos son plásmidos que generalmente consisten en un promotor viral fuerte para impulsar la transcripción y traducción in vivo del gen (o ADN complementario ) de interés. [ 18 ] A veces se puede incluir el intrón A para mejorar la estabilidad del ARNm y, por lo tanto, aumentar la expresión de la proteína. [ 19 ] Los plásmidos también incluyen una señal de poliadenilación /terminación transcripcional fuerte , como la hormona de crecimiento bovina o las secuencias de poliadenilación de la beta-globulina de conejo . [ 6 ] [ 7 ] [ 20 ] A veces se construyen vectores policistrónicos (con múltiples genes de interés) para expresar más de un inmunógeno, o para expresar un inmunógeno y una proteína inmunoestimuladora. [ 21 ]

Dado que el plásmido —que contiene un código genético relativamente pequeño de hasta aproximadamente 200 K pb— es el "vehículo" a partir del cual se expresa el inmunógeno, es esencial optimizar el diseño del vector para lograr la máxima expresión de la proteína. [ 21 ] Una forma de mejorar la expresión de la proteína es optimizando el uso de codones de los ARNm patógenos para las células eucariotas . Los patógenos suelen tener contenidos de AT diferentes a los de la especie objetivo, por lo que modificar la secuencia genética del inmunógeno para que refleje los codones más comúnmente utilizados en la especie objetivo puede mejorar su expresión. [ 22 ]  

Otra consideración es la elección del promotor . El promotor SV40 se utilizó convencionalmente hasta que la investigación mostró que los vectores impulsados ​​por el promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV) tenían tasas de expresión mucho más altas. [ 6 ] Más recientemente, la expresión y la inmunogenicidad se han incrementado aún más en sistemas modelo mediante el uso del promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV) y un elemento transcripcional cis-activo retroviral . [ 23 ] Las modificaciones adicionales para mejorar las tasas de expresión incluyen la inserción de secuencias potenciadoras, intrones sintéticos , secuencias líderes tripartitas (TPL) de adenovirus y modificaciones a las secuencias de poliadenilación y terminación transcripcional. [ 6 ] Un ejemplo de plásmido de vacuna de ADN es pVAC, que utiliza el promotor SV40 .

Los fenómenos de inestabilidad estructural son de particular interés para la fabricación de plásmidos, la vacunación con ADN y la terapia génica. [ 24 ] Las regiones accesorias pertenecientes al esqueleto del plásmido pueden participar en una amplia gama de fenómenos de inestabilidad estructural. Entre los catalizadores bien conocidos de la inestabilidad genética se incluyen las repeticiones directas, invertidas y en tándem, que son frecuentes en muchos vectores de clonación y expresión disponibles comercialmente. Por lo tanto, la reducción o eliminación completa de secuencias no codificantes extrañas en el esqueleto reduciría significativamente la propensión a que ocurran tales eventos y, en consecuencia, el potencial recombinogénico general del plásmido. [ 25 ]

Mecanismo de los plásmidos

Una vez que el plásmido se inserta en el núcleo de la célula transfectada, codifica una cadena peptídica de un antígeno extraño. En su superficie, la célula muestra el antígeno extraño con moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I y clase II. La célula presentadora de antígeno se desplaza entonces a los ganglios linfáticos y presenta el péptido antigénico y la molécula coestimuladora que envía señales a las células T, iniciando así la respuesta inmunitaria. [ 26 ]

Diseño del prospecto de la vacuna

Los inmunógenos pueden dirigirse a diversos compartimentos celulares para mejorar las respuestas de anticuerpos o de linfocitos T citotóxicos. Los antígenos secretados o unidos a la membrana plasmática son más eficaces para inducir respuestas de anticuerpos que los antígenos citosólicos , mientras que las respuestas de linfocitos T citotóxicos pueden mejorarse dirigiendo los antígenos a la degradación citoplasmática y su posterior entrada en la vía del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I. [ 7 ] Esto se suele lograr mediante la adición de señales de ubiquitina N-terminal . [ 27 ] [ 28 ] [ 29 ]

La conformación de la proteína también puede afectar las respuestas de anticuerpos. Las estructuras "ordenadas" (como las partículas virales) son más efectivas que las estructuras desordenadas. [ 30 ] Las cadenas de minigenes (o epítopos MHC de clase I ) de diferentes patógenos generan respuestas de células T citotóxicas a algunos patógenos, especialmente si también se incluye un epítopo TH. [ 7 ]

Entrega

Las técnicas de vacunación con ADN y de terapia génica son similares.

Las vacunas de ADN se han introducido en los tejidos animales mediante diversos métodos. En 1999, los dos métodos más populares eran la inyección de ADN en solución salina : mediante una aguja hipodérmica estándar o mediante un dispositivo de administración génica . [ 31 ] En los años siguientes se documentaron varias otras técnicas.

Inyección de solución salina

La inyección en solución salina normalmente se realiza por vía intramuscular (IM) en el músculo esquelético o intradérmica (ID), administrando ADN a los espacios extracelulares. Esto puede facilitarse mediante: 1) electroporación ; [ 32 ] 2) daño temporal de las fibras musculares con miotoxinas como la bupivacaína ; o 3) el uso de soluciones hipertónicas de solución salina o sacarosa . [ 6 ] Las respuestas inmunitarias a este método pueden verse afectadas por factores como el tipo de aguja, [ 16 ] la alineación de la aguja, la velocidad de inyección, el volumen de inyección, el tipo de músculo, la edad, el sexo y la condición fisiológica del receptor. [ 6 ]

pistola genética

La administración mediante pistola génica acelera balísticamente el ADN plasmídico (pDNA) que ha sido adsorbido en micropartículas de oro o tungsteno hacia las células objetivo, utilizando helio comprimido como acelerador. [ 6 ] [ 21 ]

Administración a través de la superficie mucosa

Entre las alternativas se incluyeron la instilación en aerosol de ADN desnudo en superficies mucosas , como la mucosa nasal y pulmonar , [ 21 ] y la administración tópica de pDNA en el ojo [ 33 ] y la mucosa vaginal. [ 21 ] También se ha logrado la administración en superficies mucosas utilizando preparaciones de liposomas catiónicos-ADN, [ 7 ] microesferas biodegradables , [ 34 ] [ 21 ] Salmonella atenuada , [ 35 ] vectores de Shigella o Listeria para administración oral a la mucosa intestinal [ 36 ] y vectores de adenovirus recombinantes. [ 21 ]

Vehículo de polímero

Se ha empleado un vehículo híbrido compuesto por células bacterianas y polímeros sintéticos para la administración de vacunas de ADN. Un núcleo interno de E. coli y una capa externa de poli(beta-aminoéster) funcionan sinérgicamente para aumentar la eficiencia al abordar las barreras asociadas con la administración de genes por células presentadoras de antígenos, que incluyen la captación e internalización celular, el escape del fagosoma y la concentración de la carga intracelular. Probado en ratones, se observó que el vector híbrido inducía una respuesta inmune. [ 37 ] [ 38 ]

Inmunización ELI

Otro enfoque para la vacunación con ADN es la inmunización con bibliotecas de expresión (ELI). Mediante esta técnica, potencialmente se pueden administrar todos los genes de un patógeno a la vez, lo que puede ser útil para patógenos difíciles de atenuar o cultivar. [ 6 ] La ELI se puede utilizar para identificar qué genes inducen una respuesta protectora. Esto se ha probado con Mycoplasma pulmonis , un patógeno pulmonar murino con un genoma relativamente pequeño . Incluso las bibliotecas de expresión parciales pueden inducir protección frente a una posterior infección. [ 39 ]

Dosificación

El método de administración determina la dosis necesaria para generar una respuesta inmunitaria eficaz. Las inyecciones de solución salina requieren cantidades variables de ADN, de 10  μg a 1  mg, mientras que las administraciones con pistola génica requieren de 100 a 1000 veces menos. [ 40 ] Generalmente, se requieren de 0,2  μg a 20 μg, aunque se han reportado  cantidades tan bajas como 16 ng. [ 6 ] Estas cantidades varían según la especie. Los ratones, por ejemplo, requieren aproximadamente 10 veces menos ADN que los primates . [ 7 ] Las inyecciones de solución salina requieren más ADN porque este se administra a los espacios extracelulares del tejido diana (normalmente músculo), donde debe superar barreras físicas (como la lámina basal y grandes cantidades de tejido conectivo ) antes de ser absorbido por las células, mientras que las administraciones con pistola génica introducen el ADN directamente en las células, lo que resulta en una menor "pérdida". [ 6 ] [ 7 ] 

Respuesta inmune

respuestas de las células T colaboradoras

La presentación de antígenos estimula a las células T para que se conviertan en células CD8+ citotóxicas o células CD4+ colaboradoras. Las células citotóxicas atacan directamente a otras células que portan ciertas moléculas extrañas o anormales en su superficie. Las células T colaboradoras, o células Th, coordinan las respuestas inmunitarias comunicándose con otras células. En la mayoría de los casos, las células T solo reconocen un antígeno si este se encuentra en la superficie de una célula, unido a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) del propio organismo.

La inmunización con ADN puede generar múltiples respuestas de linfocitos T , incluyendo linfoproliferación y la generación de diversos perfiles de citocinas . Una ventaja importante de las vacunas de ADN es la facilidad con la que se pueden manipular para sesgar el tipo de ayuda de las células T hacia una respuesta TH1 o TH2. [ 41 ] Cada tipo tiene patrones distintivos de expresión de linfocinas y quimiocinas, tipos específicos de inmunoglobulinas , patrones de migración de linfocitos y tipos de respuestas inmunitarias innatas .

Otros tipos de ayuda de células T

El tipo de ayuda de células T que se genera está influenciado por el método de administración y el tipo de inmunógeno expresado, así como por la focalización de diferentes compartimentos linfoides. [ 6 ] [ 42 ] Generalmente, las inyecciones de solución salina (ya sean IM o ID) tienden a inducir respuestas TH1, mientras que la administración mediante pistola génica genera respuestas TH2. [ 41 ] [ 42 ] Esto es cierto para los antígenos intracelulares y unidos a la membrana plasmática, pero no para los antígenos secretados, que parecen generar respuestas TH2, independientemente del método de administración. [ 43 ]

Generalmente, el tipo de ayuda de células T que se genera es estable en el tiempo y no cambia cuando se enfrenta a un desafío o después de inmunizaciones posteriores que normalmente habrían generado el tipo de respuesta opuesto en un espécimen ingenuo. [ 41 ] [ 42 ] Sin embargo, Mor et al . (1995) [ 18 ] inmunizaron y reforzaron ratones con pDNA que codificaba la proteína circumsporozoítica del parásito de la malaria del ratón Plasmodium yoelii (PyCSP) y encontraron que la respuesta TH2 inicial cambió, después del refuerzo, a una respuesta TH1.

Bases para los diferentes tipos de ayuda de las células T

No se comprende cómo operan estos diferentes métodos, las formas de antígeno expresadas y los diferentes perfiles de ayuda de células T. Se pensaba que las cantidades relativamente grandes de ADN utilizadas en la inyección IM eran responsables de la inducción de respuestas TH1. Sin embargo, la evidencia muestra que no hay diferencias relacionadas con la dosis en el tipo TH. [ 41 ] El tipo de ayuda de células T generada está determinado por el estado diferenciado de las células presentadoras de antígeno . Las células dendríticas pueden diferenciarse para secretar IL-12 (que apoya el desarrollo de células TH1) o IL-4 (que apoya las respuestas TH2). [ 44 ] El pDNA inyectado por aguja es endocitado en la célula dendrítica, que luego es estimulada para diferenciarse para la producción de citocina TH1 (IL-12), [ 45 ] mientras que el cañón genético bombardea el ADN directamente en la célula, evitando así la estimulación TH1.

Usos prácticos de la ayuda de células T polarizadas

La polarización en la ayuda de las células T es útil para influir en las respuestas alérgicas y las enfermedades autoinmunes . En las enfermedades autoinmunes, el objetivo es cambiar la respuesta TH1 autodestructiva (con su actividad de células T citotóxicas asociada) a una respuesta TH2 no destructiva. Esto se ha aplicado con éxito en la preparación previa a la enfermedad para el tipo de respuesta deseado en modelos preclínicos [ 7 ] y tiene cierto éxito en cambiar la respuesta en una enfermedad ya establecida. [ 46 ]

Respuestas de las células T citotóxicas

Una de las ventajas de las vacunas de ADN es que pueden inducir linfocitos T citotóxicos (CTL) sin el riesgo inherente a las vacunas vivas. Las respuestas de CTL pueden generarse contra epítopos de CTL inmunodominantes e inmunorrecesivos, [ 47 ] así como contra epítopos de CTL subdominantes , [ 34 ] de una manera que parece imitar la infección natural . Esto podría resultar una herramienta útil para evaluar los epítopos de CTL y su función en la inmunización.

Las células T citotóxicas reconocen péptidos pequeños (de 8 a 10 aminoácidos ) complejos con moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHC-I). [48] Estos péptidos se derivan de proteínas citosólicas que se degradan y se entregan a la molécula MHC-I naciente dentro del retículo endoplasmático ( RE ) . [ 48 ] Por lo tanto, dirigir los productos génicos directamente al RE (mediante la adición de una secuencia señal de inserción en el RE en el extremo N-terminal ) debería mejorar las respuestas de los linfocitos T citotóxicos (CTL). Esto se demostró con éxito utilizando virus vaccinia recombinantes que expresan proteínas de la influenza , [ 48 ] pero el principio también debería ser aplicable a las vacunas de ADN. Se demostró que dirigir los antígenos para su degradación intracelular (y por lo tanto, su entrada en la vía del MHC-I) mediante la adición de secuencias señal de ubiquitina , o la mutación de otras secuencias señal, es eficaz para aumentar las respuestas de los CTL. [ 28 ]

Las respuestas de los CTL pueden mejorarse mediante la coinoculación con moléculas coestimuladoras como B7-1 o B7-2 para vacunas de ADN contra la nucleoproteína de la influenza, [ 47 ] [ 49 ] o GM-CSF para vacunas de ADN contra el modelo murino de malaria P. yoelii . [ 50 ] Se ha demostrado que la coinoculación con plásmidos que codifican las moléculas coestimuladoras IL-12 y TCA3 aumenta la actividad de los CTL contra los antígenos de la nucleoproteína del VIH-1 y de la influenza. [ 49 ] [ 51 ]

Respuesta humoral (de anticuerpos)

Diagrama esquemático de un anticuerpo y antígenos.

Las respuestas de anticuerpos provocadas por las vacunas de ADN están influenciadas por múltiples variables, entre ellas el tipo de antígeno; la localización del antígeno (es decir, intracelular frente a secretado); el número, la frecuencia y la dosis de inmunización; el lugar y el método de administración del antígeno.

Cinética de la respuesta de anticuerpos

Las respuestas humorales tras una única inyección de ADN pueden ser mucho más duraderas que tras una única inyección de una proteína recombinante. Las respuestas de anticuerpos contra la proteína de la envoltura del virus de la hepatitis B (HBsAg) se han mantenido hasta 74 semanas sin refuerzo, mientras que se demostró el mantenimiento de por vida de la respuesta protectora a la hemaglutinina de la gripe en ratones tras la administración mediante pistola génica. [ 52 ] Las células secretoras de anticuerpos (ASC) migran a la médula ósea y al bazo para la producción de anticuerpos a largo plazo, y generalmente se localizan allí después de un año. [ 52 ]

Las comparaciones de las respuestas de anticuerpos generadas por infección natural (viral), inmunización con proteína recombinante e inmunización con pDNA se resumen en la Tabla 4. Las respuestas de anticuerpos inducidas por ADN aumentan mucho más lentamente que cuando ocurre una infección natural o una inmunización con proteína recombinante. Pueden ser necesarias hasta 12 semanas para alcanzar los títulos máximos en ratones, aunque la dosis de refuerzo puede reducir el intervalo. Esta respuesta probablemente se deba a los bajos niveles de antígeno expresados ​​durante varias semanas, lo que apoya tanto las fases primaria como secundaria de la respuesta de anticuerpos. Se inyectó una vacuna de ADN que expresaba la proteína de envoltura pequeña y media del VHB en adultos con hepatitis crónica. La vacuna resultó en la producción específica de células de interferón gamma. También se desarrollaron células T específicas para los antígenos de las proteínas de envoltura media. La respuesta inmune de los pacientes no fue lo suficientemente robusta como para controlar la infección por VHB [ 53 ].

Además, los títulos de anticuerpos específicos generados por la vacunación con ADN son menores que los obtenidos tras la vacunación con una proteína recombinante. Sin embargo, los anticuerpos inducidos por la inmunización con ADN muestran mayor afinidad por los epítopos nativos que los inducidos por la vacunación con proteína recombinante. En otras palabras, la inmunización con ADN induce una respuesta cualitativamente superior. Los anticuerpos pueden inducirse tras una sola vacunación con ADN, mientras que las vacunaciones con proteína recombinante generalmente requieren una dosis de refuerzo. La inmunización con ADN puede utilizarse para influir en el perfil TH de la respuesta inmunitaria y, por lo tanto, en el isotipo del anticuerpo, lo cual no es posible ni con la infección natural ni con la vacunación con proteína recombinante. Las respuestas de anticuerpos generadas por ADN son útiles como herramienta preparativa. Por ejemplo, se pueden generar anticuerpos policlonales y monoclonales para su uso como reactivos.

Base mecanicista de las respuestas inmunitarias mediadas por el ADN

Mecanismo de captación de ADN

Cuando se demostró por primera vez la captación de ADN y su posterior expresión in vivo en células musculares , [ 54 ] se pensó que estas células eran únicas debido a su extensa red de túbulos T. Utilizando microscopía electrónica , se propuso que la captación de ADN era facilitada por caveolas (o fosas no recubiertas de clatrina). [ 55 ] Sin embargo, investigaciones posteriores revelaron que otras células (como queratinocitos , fibroblastos y células epiteliales de Langerhans ) también podían internalizar ADN. [ 46 ] [ 56 ] El mecanismo de captación de ADN es desconocido.

Dos teorías predominan: que la captación in vivo de ADN ocurre de forma no específica, en un método similar a la fagocitosis o pinocitosis , [ 21 ] o a través de receptores específicos. [ 57 ] Estos podrían incluir un receptor de superficie de 30 kDa o receptores depuradores de macrófagos . El receptor de superficie de 30 kDa se une específicamente a fragmentos de ADN de 4500 pb (que luego se internalizan) y se encuentra en APC profesionales y células T. Los receptores depuradores de macrófagos se unen a una variedad de macromoléculas, incluidos los polirribonucleótidos y , por lo tanto, son candidatos para la captación de ADN. [ 57 ] [ 58 ] La captación de ADN mediada por receptores podría verse facilitada por la presencia de secuencias de poliguanilato . Los sistemas de administración de pistolas génicas , el empaquetamiento de liposomas catiónicos y otros métodos de administración evitan este método de entrada, pero comprenderlo puede ser útil para reducir costos (por ejemplo, al reducir el requerimiento de citofectinas), lo que podría ser importante en la cría de animales.

Presentación de antígenos por células derivadas de la médula ósea

Una célula dendrítica

Estudios realizados con ratones quiméricos han demostrado que el antígeno es presentado por células derivadas de la médula ósea, que incluyen células dendríticas, macrófagos y células B especializadas llamadas células presentadoras de antígeno profesionales (APC). [ 49 ] [ 59 ] Después de la inoculación con pistola génica en la piel, las células de Langerhans transfectadas migran al ganglio linfático de drenaje para presentar antígenos. [ 7 ] Después de inyecciones IM e ID, las células dendríticas presentan antígeno en el ganglio linfático de drenaje [ 56 ] y se han encontrado macrófagos transfectados en la sangre periférica. [ 60 ]

Además de la transfección directa de células dendríticas o macrófagos, la presentación cruzada ocurre tras la administración de ADN por vía intramuscular, intradérmica y mediante pistola génica. La presentación cruzada se produce cuando una célula derivada de la médula ósea presenta péptidos de proteínas sintetizadas en otra célula en el contexto del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHC-I). Esto puede preparar las respuestas de las células T citotóxicas y parece ser importante para una respuesta inmunitaria primaria completa. [ 7 ] [ 61 ]

Función del sitio objetivo

La administración intramuscular (IM) e intradérmica (ID) de ADN inicia respuestas inmunitarias de manera diferente. En la piel, los queratinocitos, fibroblastos y células de Langerhans captan y expresan antígenos y son responsables de inducir una respuesta primaria de anticuerpos. Las células de Langerhans transfectadas migran fuera de la piel (en 12 horas) hacia el ganglio linfático de drenaje, donde preparan respuestas secundarias de células B y T. En el músculo esquelético, las células musculares estriadas son las que se transfectan con mayor frecuencia, pero parecen no ser importantes en la respuesta inmunitaria. En cambio, el ADN inoculado intramuscularmente se "lava" hacia el ganglio linfático de drenaje en cuestión de minutos, donde las células dendríticas distales se transfectan y luego inician una respuesta inmunitaria. Los miocitos transfectados parecen actuar como un "reservorio" de antígeno para el tráfico de células presentadoras de antígeno (APC) profesionales. [ 21 ] [ 54 ] [ 61 ]

Mantenimiento de la respuesta inmunitaria

La vacunación con ADN genera una memoria inmunológica eficaz mediante la presentación de complejos antígeno-anticuerpo en las células dendríticas foliculares (FDC), que son potentes estimuladoras de las células B. Las células T pueden ser estimuladas por células dendríticas similares del centro germinal. Las FDC son capaces de generar una memoria inmunológica porque la producción de anticuerpos se superpone a la expresión a largo plazo del antígeno, lo que permite que se formen inmunocomplejos antígeno-anticuerpo y que las FDC los presenten. [ 7 ]

Interferones

Tanto las células T auxiliares como las citotóxicas pueden controlar las infecciones virales secretando interferones. Las células T citotóxicas generalmente matan las células infectadas por virus. Sin embargo, también pueden ser estimuladas para secretar citocinas antivirales como IFN-γ y TNF-α , que no matan la célula, pero limitan la infección viral al regular negativamente la expresión de componentes virales. [ 62 ] Las vacunas de ADN pueden usarse para frenar las infecciones virales mediante un control no destructivo mediado por IFN. Esto se demostró para la hepatitis B. [ 63 ] El IFN-γ es de vital importancia en el control de las infecciones de malaria [ 64 ] y es una consideración para las vacunas de ADN antipalúdicas.

Modulación de la respuesta inmunitaria

Modulación de citoquinas

Una vacuna eficaz debe inducir una respuesta inmunitaria apropiada para un patógeno determinado. Las vacunas de ADN pueden polarizar la ayuda de las células T hacia perfiles TH1 o TH2 y generar CTL y/o anticuerpos cuando sea necesario. Esto se puede lograr mediante modificaciones en la forma del antígeno expresado (es decir, intracelular frente a secretado), el método y la vía de administración o la dosis. [ 41 ] [ 42 ] [ 65 ] [ 66 ] [ 67 ] También se puede lograr mediante la coadministración de ADN plasmídico que codifica moléculas inmunorreguladoras, es decir, citocinas, linfocinas o moléculas coestimuladoras. Estos " adyuvantes genéticos " se pueden administrar como:

  • mezcla de 2 plásmidos, uno que codifica el inmunógeno y el otro que codifica la citocina
  • Vector bi- o policistrónico único, separado por regiones espaciadoras.
  • quimera codificada por plásmido o proteína de fusión

En general, la coadministración de agentes proinflamatorios (como diversas interleucinas , factor de necrosis tumoral y GM-CSF) junto con citocinas inductoras de TH2 aumenta las respuestas de anticuerpos, mientras que los agentes proinflamatorios y las citocinas inductoras de TH1 disminuyen las respuestas humorales y aumentan las respuestas citotóxicas (más importantes en la protección antiviral). En ocasiones se utilizan moléculas coestimuladoras como B7-1 , B7-2 y CD40L .

Este concepto se aplicó en la administración tópica de pDNA que codifica IL-10 . [ 33 ] El plásmido que codifica B7-1 (un ligando en APC) mejoró con éxito la respuesta inmune en modelos tumorales. La mezcla de plásmidos que codifican GM-CSF y la proteína circumsporozoítica de P. yoelii (PyCSP) mejoró la protección contra el desafío posterior (mientras que el plásmido codificado PyCSP solo no lo hizo). Se propuso que GM-CSF hizo que las células dendríticas presentaran antígeno de manera más eficiente y mejoraran la producción de IL-2 y la activación de células TH, impulsando así el aumento de la respuesta inmune. [ 50 ] Esto puede mejorarse aún más mediante una primoinmunización con una mezcla de pPyCSP y pGM-CSF, seguida de una dosis de refuerzo con un poxvirus recombinante que expresa PyCSP. [ 68 ] Sin embargo, la coinyección de plásmidos que codifican GM-CSF (o IFN-γ, o IL-2) y una proteína de fusión de la proteína de superficie del merozoito 1 de P. chabaudi (extremo C)-proteína de superficie del virus de la hepatitis B (PcMSP1-HBs) abolió la protección contra el desafío, en comparación con la protección adquirida mediante la administración de pPcMSP1-HBs sola. [ 30 ]

Las ventajas de los adyuvantes genéticos son su bajo costo y administración sencilla, así como la evitación de citocinas recombinantes inestables y adyuvantes "convencionales" potencialmente tóxicos (como alumbre , fosfato de calcio , monofosforil lípido A, toxina colérica , liposomas recubiertos de manano y catiónicos, QS21 , carboximetilcelulosa y ubenimex ). [ 7 ] [ 21 ] Sin embargo, no se ha establecido la toxicidad potencial de la expresión prolongada de citocinas. En muchas especies animales de importancia comercial, no se han identificado ni aislado genes de citocinas. Además, varias citocinas codificadas por plásmidos modulan el sistema inmunitario de manera diferente según el momento de administración. Por ejemplo, algunos ADN plasmídicos de citocinas se administran mejor después del pADN inmunógeno, porque la administración previa o simultánea puede disminuir las respuestas específicas y aumentar las respuestas no específicas. [ 69 ]

Motivos CpG inmunoestimuladores

El ADN plasmídico en sí mismo parece tener un efecto adyuvante en el sistema inmunitario. [ 6 ] [ 7 ] El ADN derivado de bacterias puede desencadenar mecanismos de defensa inmunitaria innata, la activación de células dendríticas y la producción de citocinas TH1. [ 45 ] [ 70 ] Esto se debe al reconocimiento de ciertas secuencias de dinucleótidos CpG que son inmunoestimuladoras. [ 66 ] [ 71 ] Las secuencias estimuladoras de CpG (CpG-S) ocurren veinte veces más frecuentemente en el ADN derivado de bacterias que en eucariotas. Esto se debe a que los eucariotas exhiben "supresión de CpG", es decir, los pares de dinucleótidos CpG ocurren con mucha menos frecuencia de lo esperado. Además, las secuencias CpG-S están hipometiladas. Esto ocurre frecuentemente en el ADN bacteriano, mientras que los motivos CpG que ocurren en eucariotas están metilados en el nucleótido de citosina. Por el contrario, las secuencias de nucleótidos que inhiben la activación de una respuesta inmune (denominadas CpG neutralizantes o CpG-N) están sobrerrepresentadas en los genomas eucariotas. [ 72 ] La secuencia inmunoestimuladora óptima es un dinucleótido CpG no metilado flanqueado por dos purinas 5' y dos pirimidinas 3' . [ 66 ] [ 70 ] Además, las regiones flanqueantes fuera de este hexámero inmunoestimulador deben ser ricas en guanina para asegurar la unión y la captación en las células diana.

El sistema innato trabaja con el sistema inmunitario adaptativo para generar una respuesta contra la proteína codificada en el ADN. Las secuencias CpG-S inducen la activación policlonal de las células B y la regulación positiva de la expresión y secreción de citocinas. [ 73 ] Los macrófagos estimulados secretan IL-12, IL-18 , TNF-α, IFN-α, IFN-β e IFN-γ, mientras que las células B estimuladas secretan IL-6 y algo de IL-12. [ 21 ] [ 73 ] [ 74 ]

La manipulación de las secuencias CpG-S y CpG-N en el esqueleto del plásmido de las vacunas de ADN puede asegurar el éxito de la respuesta inmune al antígeno codificado y dirigir la respuesta inmune hacia un fenotipo TH1. Esto es útil si un patógeno requiere una respuesta TH para la protección. Las secuencias CpG-S también se han utilizado como adyuvantes externos para la vacunación con ADN y proteínas recombinantes con tasas de éxito variables. Otros organismos con motivos CpG hipometilados han demostrado la estimulación de la expansión policlonal de células B. [ 75 ] El mecanismo detrás de esto puede ser más complicado que la simple metilación: no se ha encontrado que el ADN murino hipometilado genere una respuesta inmune.

La mayor parte de la evidencia sobre las secuencias CpG inmunoestimuladoras proviene de estudios en ratones. La extrapolación de estos datos a otras especies requiere precaución, ya que cada especie puede requerir secuencias flanqueantes diferentes, dado que la especificidad de unión de los receptores depuradores varía entre especies. Además, especies como los rumiantes pueden ser insensibles a las secuencias inmunoestimuladoras debido a la gran carga gastrointestinal.

Impulsores alternativos

Las respuestas inmunitarias iniciadas por ADN pueden potenciarse mediante la administración de proteína recombinante o poxvirus recombinantes. Las estrategias de "inmunización inicial y posterior" con proteína recombinante han logrado aumentar tanto el título de anticuerpos neutralizantes como la avidez y persistencia de los anticuerpos para inmunógenos débiles, como la proteína de la envoltura del VIH-1. [ 7 ] [ 76 ] Se ha demostrado que las dosis de refuerzo con virus recombinantes son muy eficaces para potenciar las respuestas de CTL iniciadas por ADN. La inmunización inicial con ADN centra la respuesta inmunitaria en el inmunógeno requerido, mientras que el refuerzo con el virus recombinante proporciona una mayor cantidad de antígeno expresado, lo que conduce a un gran aumento en las respuestas de CTL específicas.

Las estrategias de primovacunación y refuerzo han tenido éxito en inducir protección contra el desafío palúdico en varios estudios. Ratones primovacunados con ADN plasmídico que codifica la proteína de superficie circumsporozoítica de Plasmodium yoelii (PyCSP), y luego reforzados con un virus vaccinia recombinante que expresa la misma proteína tuvieron niveles significativamente más altos de anticuerpos, actividad CTL e IFN-γ, y por lo tanto mayores niveles de protección, que los ratones inmunizados y reforzados solo con ADN plasmídico. [ 77 ] Esto puede mejorarse aún más mediante la primovacunación con una mezcla de plásmidos que codifican PyCSP y GM-CSF murino, antes del refuerzo con el virus vaccinia recombinante. [ 68 ] También se ha demostrado una estrategia de primovacunación y refuerzo eficaz para el modelo de malaria simia P. knowlesi . [ 78 ] Se preparó a monos rhesus con una vacuna de ADN multicomponente y multietapa que codificaba dos antígenos de la etapa hepática: la proteína de superficie circumsporozoítica (PkCSP) y la proteína de superficie esporozoítica 2 (PkSSP2), y dos antígenos de la etapa sanguínea: la proteína de superficie merozoítica apical 1 (PkAMA1) y la proteína de superficie merozoítica 1 (PkMSP1p42). Posteriormente, se les administró una dosis de refuerzo con un virus recombinante de viruela canaria que codificaba los cuatro antígenos (ALVAC-4). Los monos inmunizados desarrollaron anticuerpos contra esporozoítos y eritrocitos infectados, y respuestas de células T secretoras de IFN-γ contra péptidos de PkCSP. Se logró una protección parcial contra el desafío con esporozoítos y la parasitemia media se redujo significativamente, en comparación con los monos de control. Estos modelos, si bien no son ideales para la extrapolación a P. falciparum en humanos, serán importantes en ensayos preclínicos.

Potenciar las respuestas inmunitarias

ADN

La eficacia de la inmunización con ADN puede mejorarse estabilizando el ADN frente a la degradación y aumentando la eficiencia de su administración a las células presentadoras de antígenos . [ 7 ] Esto se ha demostrado recubriendo micropartículas catiónicas biodegradables (como el poli(lactida-co-glicólido) formulado con bromuro de cetiltrimetilamonio ) con ADN. Estas micropartículas recubiertas de ADN pueden ser tan eficaces para inducir linfocitos T citotóxicos como los virus recombinantes, especialmente cuando se mezclan con alumbre. Las partículas de 300  nm de diámetro parecen ser las más eficientes para su captación por las células presentadoras de antígenos. [ 7 ]

Vectores de alfavirus

Se han utilizado vectores recombinantes basados ​​en alfavirus para mejorar la eficacia de la vacunación con ADN. [ 7 ] El gen que codifica el antígeno de interés se inserta en el replicón del alfavirus, reemplazando los genes estructurales pero dejando intactos los genes de la replicasa no estructurales. El virus Sindbis y el virus del bosque de Semliki se han utilizado para construir replicones recombinantes de alfavirus . A diferencia de las vacunas de ADN convencionales, los vectores de alfavirus matan las células transfectadas y se expresan solo transitoriamente. Los genes de la replicasa del alfavirus se expresan además del inserto de la vacuna. No está claro cómo los replicones de alfavirus generan una respuesta inmune, pero puede deberse a los altos niveles de proteína expresada por este vector, a las respuestas de citoquinas inducidas por el replicón o a la apoptosis inducida por el replicón que conduce a una mayor captación de antígeno por las células dendríticas.

Véase también

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Lecturas adicionales

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