pirosecuenciación

La pirosecuenciación es un método de secuenciación de ADN no electroforético (que determina el orden de los nucleótidos en el ADN) basado en el principio de "secuenciación por síntesis", en el que la secuenciación se realiza detectando el nucleótido incorporado por una ADN polimerasa . La pirosecuenciación se basa en la detección de luz mediante una reacción en cadena que se produce cuando se libera pirofosfato , de ahí su nombre.

El principio de la pirosecuenciación fue descrito por primera vez en 1993 por P. Nyrén , B. Pettersson y M. Uhlen . ^{[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]} La técnica combina la secuenciación en fase sólida y el uso de microesferas magnéticas recubiertas de estreptavidina , una ADN polimerasa recombinante que carece de actividad exonucleasa 3´-a-5´ (corrección de errores) y la detección por luminiscencia de pirofosfato inorgánico mediante la enzima luciferasa de luciérnaga . ^{[ 4 ] [ 5 ]}

Específicamente, se añade una solución de tres enzimas —ADN polimerasa , ATP sulfurilasa y luciferasa de luciérnaga— y un desoxirribonucleótido trifosfato (dNTP) al ADN monocatenario que se va a secuenciar. Se monitoriza la incorporación de nucleótidos midiendo la luz emitida como consecuencia de la producción de pirofosfato inorgánico. La intensidad de la luz determina si se han incorporado 0, 1 o más nucleótidos, lo que indica cuántos nucleótidos complementarios hay en la cadena molde. Se retira la mezcla de nucleótidos antes de añadir la siguiente, y el proceso se repite para cada uno de los cuatro nucleótidos, hasta determinar la secuencia de ADN del molde monocatenario.

En 1998 , Mostafa Ronaghi , Mathias Uhlen ^y Pål ^{Nyren describieron} un segundo método basado en soluciones para la pirosecuenciación . En este método alternativo, se introduce una enzima adicional, la apirasa , para eliminar los nucleótidos que no son incorporados por la ADN polimerasa. Esto permite añadir la mezcla de enzimas ( ADN polimerasa , luciferasa y apirasa ) al iniciar la secuenciación y mantenerla en la solución de reacción durante todo el procedimiento (lo que facilita la automatización). Al año siguiente, la empresa Pyrosequencing lanzó al mercado un instrumento automatizado basado en este principio.

Una tercera variante, un método de pirosecuenciación microfluídica, fue descrita en 2005 por un equipo de investigación industrial liderado por Jonathan Rothberg , en la empresa 454 Life Sciences . ^{[ 7 ] [ 3 ]} Este enfoque alternativo para la pirosecuenciación se basó en el principio original de unir el ADN a secuenciar a un soporte sólido; Rothberg y sus colaboradores demostraron que la secuenciación podía realizarse de manera altamente paralela utilizando una microfabricación y microarrays . Esto permitió la secuenciación de ADN de alto rendimiento, y se introdujo un instrumento automatizado en el mercado. Este primer instrumento de secuenciación de próxima generación inició una nueva era en la investigación genómica y en la rápida disminución de los precios de la secuenciación de ADN , lo que permitió la secuenciación asequible del genoma completo .

La "secuenciación por síntesis" consiste en tomar una sola hebra del ADN que se va a secuenciar y sintetizar enzimáticamente su hebra complementaria. El método de pirosecuenciación se basa en la detección de la actividad de la ADN polimerasa (una enzima que sintetiza el ADN) con otra enzima quimioluminiscente . Básicamente, el método permite secuenciar una sola hebra de ADN sintetizando la hebra complementaria a lo largo de ella, un par de bases a la vez, y detectando qué base se añadió en cada paso. El ADN molde es inmóvil, y se añaden y retiran secuencialmente soluciones de nucleótidos A, C, G y T de la reacción. La luz se produce solo cuando la solución de nucleótidos complementa la primera base no apareada del molde. La secuencia de soluciones que producen señales quimioluminiscentes permite determinar la secuencia del molde. ^{[ 8 ] [ 1 ] [ 3 ]}

Para la versión en solución de la pirosecuenciación, la plantilla de ADN monocatenario ( ssDNA ) se hibrida con un cebador de secuenciación y se incuba con las enzimas ADN polimerasa , ATP sulfurilasa , luciferasa y apirasa , y con los sustratos adenosina 5´ fosfosulfato (APS) y luciferina . ^{[ 8 ]}

1. La adición de uno de los cuatro desoxinucleótidos trifosfato inicia el segundo paso; se añade dATPαS (dNTPs ), que no es un sustrato para la luciferasa, en lugar de dATP para evitar interferencias. La ADN polimerasa incorpora los dNTPs correctos y complementarios al molde. Esta incorporación libera pirofosfato (PPi). ^{[ 8 ]}

1. La ATP sulfurilasa convierte PPi en ATP en presencia de adenosina 5´ fosfosulfato. Este ATP actúa como sustrato para la conversión de luciferina en oxiluciferina, mediada por la luciferasa, que genera luz visible en cantidades proporcionales a la cantidad de PPi. La luz producida en la reacción catalizada por la luciferasa es detectada por una cámara y analizada mediante un programa. ^{[ 8 ]}

1. Los nucleótidos no incorporados y el ATP son degradados por la apirasa , y la reacción puede reiniciarse con otro nucleótido. ^{[ 8 ]}

El proceso puede representarse mediante las siguientes ecuaciones:

• PPi + APS → ATP + Sulfato (catalizado por la ATP-sulfurilasa);
• ATP + luciferina + O2 → AMP + PPi + oxiluciferina + CO ₂ + hv (catalizado por la luciferasa);

donde PPi es pirofosfato, APS es adenosina 5-fosfosulfato, ATP es adenosina trifosfato, O2 es oxígeno disódico , AMP es adenosina monofosfato, CO2 es dióxido _de carbono y hv es luz. ^{[ 8 ]}

Actualmente, una limitación del método es que la longitud de las lecturas individuales de secuencias de ADN se sitúa en torno a los 300-500 nucleótidos, más corta que los 800-1000 que se obtienen con los métodos de terminación de cadena (por ejemplo, la secuenciación de Sanger). Esto puede dificultar el proceso de ensamblaje del genoma , especialmente para secuencias que contienen una gran cantidad de ADN repetitivo . Además, la falta de un mecanismo de corrección de errores limita la precisión de este método.

Pyrosequencing AB, una empresa con sede en Uppsala, Suecia , fue fundada con capital de riesgo proporcionado por HealthCap para comercializar maquinaria y reactivos para secuenciar segmentos cortos de ADN utilizando la técnica de pirosecuenciación. ^{[ 9 ]} Pyrosequencing AB cotizó en la Bolsa de Valores de Estocolmo en 1999. ^{[ 9 ]} Cuando Pyrosequencing AB adquirió Biotage LLC, una empresa con sede en EE. UU., y otras empresas, en 2003, la empresa pasó a llamarse Biotage AB. ^{[ 9 ]} Las unidades de pirosecuenciación y otras unidades biomédicas de Biotage AB fueron vendidas a Qiagen en 2008. ^{[ 9 ]} La tecnología de pirosecuenciación fue licenciada a 454 Life Sciences . 454 desarrolló una tecnología de pirosecuenciación basada en matrices que surgió como una plataforma para la secuenciación de ADN a gran escala , incluyendo la secuenciación del genoma y la metagenómica .

Roche adquirió 454 Life Sciences y anunció la descontinuación de la plataforma de secuenciación 454 en 2013. ^{[ 10 ]} La plataforma de secuenciación 454 fue reemplazada, en parte, por la secuenciación de tintes de Illumina y por los productos de secuenciación de Applied Biosystems.

• Harrington, CT; Lin, EI; Olson, MT y Eshleman, JR (1 de septiembre de 2013). "Fundamentos de la pirosecuenciación" . Arco. Patol. Laboratorio. Med . 137 (9): 1296– 1303. doi : 10.5858/arpa.2012-0463-RA . PMID 23991743 . Consultado el 29 de octubre de 2025 . {{cite journal}}: CS1 maint: nombres múltiples: lista de autores ( enlace ) Para el documento PDF correspondiente, consulte este enlace .

• Metzker M. (2005). "Tecnologías emergentes en la secuenciación de ADN" . Genome Research . 15 (12): 1767– 76. doi : 10.1101/gr.3770505 . PMID 16339375 .