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CAPP-Seq

CAPP-Seq ( perfilado personalizado de cáncer mediante secuenciación profunda ) es un método basado en secuenciación de próxima generación que se utiliza para cuantificar el ADN ...

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CAPP-Seq ( perfilado personalizado de cáncer mediante secuenciación profunda ) es un método basado en secuenciación de próxima generación que se utiliza para cuantificar el ADN circulante en el cáncer ( ADNct ). El método fue introducido en 2014 por los laboratorios de Ash Alizadeh y Maximilian Diehn en Stanford, como una herramienta para medir el ADN tumoral libre de células que se libera de las células tumorales muertas en la sangre y, por lo tanto, puede reflejar todo el genoma tumoral. Este método se puede generalizar para cualquier tipo de cáncer que se sepa que tiene mutaciones recurrentes. [ 1 ] CAPP-Seq puede detectar una molécula de ADN mutante en 10 000 moléculas de ADN sano. El método original [ 1 ] se perfeccionó aún más en 2016 para una detección ultrasensible mediante la integración de múltiples estrategias de supresión de errores, denominadas supresión digital de errores integrada (iDES). [ 2 ] El uso de ADNct en esta técnica no debe confundirse con las células tumorales circulantes (CTC); son dos entidades diferentes. [ 3 ]

Originalmente descrito como un método para detectar y monitorear cánceres de pulmón, [ 1 ] [ 2 ] CAPP-Seq ha sido adaptado con éxito para una amplia gama de cánceres por múltiples grupos independientes. Estos incluyen linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), [ 4 ] linfoma folicular (FL), [ 4 ] trastorno linfoproliferativo postrasplante (PTLD), [ 5 ] cáncer colorrectal metastásico en ovario, [ 6 ] cáncer de esófago , [ 7 ] cáncer de páncreas , [ 8 ] cáncer de vejiga , [ 9 ] leiomiosarcoma , [ 10 ] diversos sarcomas en adultos y niños , [ 11 ] entre otros.

Método

Figura 01: Descripción general del flujo de trabajo de CAPP-Seq.

El análisis poblacional se realiza para identificar mutaciones recurrentes en un tipo de cáncer determinado. Esto se lleva a cabo analizando conjuntos de datos públicos como la base de datos de cáncer COSMIC y TCGA . Se diseña un "selector" que consiste en sondas de oligonucleótidos de ADN biotinilados dirigidas a las regiones mutadas recurrentemente elegidas para el tipo de cáncer específico. El selector se elige mediante un enfoque bioinformático multifásico . Utilizando el selector, se realiza una captura de hibridación basada en sondas en ADN tumoral y normal para descubrir mutaciones específicas del paciente. La captura de hibridación también se aplica al ADN tumoral circulante (ctDNA) para cuantificar las mutaciones previamente descubiertas. [ 1 ]

Extracción de ADN circulante tumoral y preparación de la biblioteca

Se extrae sangre periférica de los pacientes y se aísla el ADN circulante tumoral (ctDNA) a partir de ≥1 mL de plasma . La cantidad de ADN inicial puede ser tan baja como 4  ng. [ 1 ]

La adaptación de este protocolo para el trabajo con ADN circulante tumoral (ctDNA) tuvo cuatro objetivos principales:

  • 1) para optimizar la eficiencia de la ligadura del adaptador
  • 2) reducir el número de ciclos de PCR necesarios después de la ligación
  • 3) preservar la distribución de tamaño natural del ADN circulante (mediana de 170 pares de bases).
  • 4) minimizar la variabilidad en la profundidad de cobertura de secuencia en todas las regiones capturadas.

Esto se logró permitiendo que la ligación de adaptadores se realizara a 16 °C durante 16 horas para aumentar la eficiencia y la recuperación de la ligación. La adaptación más importante se produce durante las etapas enzimáticas y de purificación; estas se realizan con microesferas para minimizar los pasos de transferencia de tubos, lo que aumenta la recuperación.

Diseño del selector

En CAPP-Seq, el diseño del selector es un paso crucial que identifica mutaciones recurrentes en un tipo de cáncer específico utilizando datos de secuenciación de próxima generación disponibles públicamente. Para su inclusión en el selector de CAPP-seq, las mutaciones recurrentes que se encuentran enriquecidas en una población se describen mediante un índice: el Índice de Recurrencia (IR). El IR es el número de mutaciones por kilobase de un locus genómico determinado de un paciente portador de mutaciones específicas. El IR representa una frecuencia de recurrencia a nivel de paciente estimada para mutaciones somáticas y todas las mutaciones. Las mutaciones recurrentes conocidas y las mutaciones impulsoras en una población se pueden clasificar en función del IR, y por lo tanto, el IR se utiliza para diseñar un selector. Se emplea una estrategia de diseño de seis fases para diseñar el selector. [ 1 ]

  • Fase 1: Identificación de mutaciones conductoras conocidas que se reproducen con frecuencia utilizando datos disponibles públicamente.
  • Fase 2: Se identificó la cobertura máxima de SNV entre los pacientes clasificando su RI exónico.
  • Fases 3 y 4: Se seleccionaron exones con un índice de reproducción (IR) más alto.
  • Fase 5: Adición de las mutaciones impulsoras predichas previamente.
  • Fase 6: Adición de reordenamientos de fusiones genéticas recurrentes que son específicos para un tipo particular de cáncer.

El cáncer humano es heterogéneo y las mutaciones recurrentes solo se presentan en una minoría de pacientes. Por lo tanto, un diseño cuidadoso y no redundante del selector es fundamental en CAPP-Seq, y el tamaño del selector también está relacionado con sus costos posteriores.

Figura 02: Protocolo de captura por hibridación utilizado en CAPP-Seq.

Captura por hibridación y secuenciación

La hibridación con sondas selectoras se realiza en ADN tumoral de una biopsia y se secuencia con una cobertura de aproximadamente 10 000×. Las sondas selectoras biotiniladas se unen selectivamente a las regiones de la biblioteca de ADN donde se producen las mutaciones recurrentes en el tipo de cáncer en cuestión. De esta forma, se obtiene una biblioteca más pequeña, enriquecida únicamente con las regiones de interés, que posteriormente se secuencia. Esto permite determinar las mutaciones específicas de cada paciente. A continuación, se realiza una hibridación con el mismo selector en el ADN tumoral circulante (ADNtc) de la sangre para cuantificar las mutaciones previamente identificadas en el paciente. CAPP-Seq se puede aplicar al ADNtc de múltiples muestras de sangre en diferentes momentos para monitorizar la evolución del tumor.

Proceso computacional para CAPP-seq

El análisis de datos CAPP-Seq implica una serie de pasos, desde la detección de mutaciones hasta la validación, y el software de código abierto puede realizar la mayor parte del análisis. Tras el primer paso de detección de variantes, se eliminan las mutaciones de la línea germinal y la pérdida de heterocigosidad (LOH) en CAPP-seq para reducir los sesgos de fondo. Se pueden realizar varias pruebas de significación estadística frente al fondo para cada tipo de detección de variantes. Por ejemplo, la significación estadística de los SNV derivados de tumores se puede estimar mediante el muestreo aleatorio de alelos de fondo utilizando el método de Monte Carlo . Para las llamadas de indel, la significación estadística se calcula aplicando un método separado que utiliza un análisis específico de la hebra mediante la prueba Z, como se muestra en trabajos anteriores. [ 1 ] Finalmente, los pasos de validación computacional reducen las llamadas de falsos positivos. Sin embargo, un marco computacional robusto específico para el análisis de datos CAPP-seq es muy necesario en este campo.

Sensibilidad

La sensibilidad de esta tecnología depende del diseño efectivo del selector y está altamente sesgada por el tamaño de la cohorte y el tipo de cáncer en estudio. La falta de información de fondo para encontrar variantes recurrentes estadísticamente significativas ha limitado su rendimiento debido al ruido estocástico y la variabilidad biológica. El análisis de la curva ROC ( característica operativa del receptor ) en varios pacientes con cáncer y pacientes curados de cáncer (muestras recolectadas en diferentes etapas tumorales, puntos temporales de ADN circulante, tratamientos, etc.) mostró que CAPP-seq tiene mayor sensibilidad y especificidad en comparación con métodos anteriores en cáncer de pulmón de células no pequeñas. [ 1 ]

Limitaciones

El límite de detección de CAPP-Seq se ve afectado por tres áreas principales: la cantidad de moléculas de ctDNA de entrada, la contaminación cruzada de la muestra, el posible sesgo alélico en el reactivo de captura y los errores de PCR o secuenciación. El ctDNA se puede detectar con un límite inferior de abundancia fraccional del 0,025 % en la sangre. Se ha observado que la contaminación cruzada de la muestra contribuye muy poco y los informes han mostrado un sesgo alélico mínimo hacia la captura de alelos de referencia en linfocitos de sangre periférica (LSP). Los errores de PCR y secuenciación también son mínimos. [ 1 ] La técnica se vuelve cuestionable cuando el ctDNA está presente en niveles bajos del 0,01 %. Además, cuando hay una menor liberación de ctDNA debido a la estabilidad del crecimiento tumoral por la terapia, la detección se ve comprometida. [ 12 ] [ 13 ]

Aún se desconoce si el ADN tumoral circulante (ADNtc) se libera a ritmos iguales o desiguales desde los tumores primarios y las metástasis . Este hecho debe tenerse en cuenta al realizar CAPP-Seq, ya que puede causar problemas para determinar la carga tumoral y la evolución clonal si diferentes tumores o clones mueren y liberan su ADN a ritmos distintos. También se desconoce cómo afecta la histología tumoral a la liberación de ADNtc. [ 1 ]

Otra limitación importante al usar solo los niveles de ctDNA para detectar la carga tumoral es que el ctDNA solo puede predecir el tumor residual, pero no puede decir nada sobre la ubicación del tumor. Esto significa que CAPP-Seq se puede usar mejor como complemento de otros enfoques de secuenciación [ 10 ] para obtener imágenes de la carga de la enfermedad en diferentes momentos. Por lo tanto, la sensibilidad técnica, la reproducibilidad, la especificidad y la necesidad de experiencia para el análisis de grandes cantidades de datos son algunos de los problemas que preocupan con esta técnica.

Ventajas

CAPP-Seq presenta numerosas ventajas sobre otros métodos como la reacción en cadena de la polimerasa digital (dPCR) y la secuenciación de amplicones . CAPP-Seq permite analizar múltiples loci en un mismo experimento, a diferencia de dPCR y la secuenciación de amplicones, que requieren varios experimentos diferentes y, por lo tanto, consumen mucha más muestra. Otra ventaja es que CAPP-Seq no solo detecta mutaciones puntuales, sino también inserciones/deleciones , variaciones estructurales y variaciones en el número de copias [ 14 ] , y además facilita el seguimiento de la enfermedad residual mínima [ 15 ] .

Otra ventaja de CAPP-Seq es que, al dirigirse únicamente a áreas específicas de interés en el genoma, resulta más rentable que la secuenciación del exoma completo y la secuenciación del genoma completo , que son 171X y 44X más caras respectivamente. [ 1 ] Además, no requiere una optimización discreta para cada paciente.

El uso de ADN tumoral circulante, en lugar de biopsias de tumores sólidos, permite analizar el repertorio completo de células tumorales dispersas por todo el tumor y las metástasis a distancia. Por lo tanto, existe una mayor probabilidad de detectar todas las mutaciones asociadas con este cáncer. Contar con una visión integral del cáncer y sus factores desencadenantes permitirá desarrollar mejores planes de tratamiento y un manejo más eficaz de la enfermedad.

Aplicaciones

Monitorización de la carga tumoral

Al tratar el cáncer, es útil contar con mediciones precisas de la carga tumoral total del cuerpo. Esto ayuda a determinar el significado pronóstico y la respuesta al tratamiento. Normalmente, esto se realiza mediante tomografía computarizada (TC), tomografía por emisión de positrones (PET) o resonancia magnética (RM). [ 16 ] Estos procedimientos de diagnóstico por imagen son costosos y presentan sus propios problemas. Estas técnicas de imagen no permiten visualizar con precisión tumores pequeños (≤1  cm de diámetro). [ 14 ] Las imágenes también pueden verse afectadas por la inflamación y los cambios fibróticos inducidos por la radiación, lo que dificulta determinar si existe tumor residual o simplemente efectos del tratamiento. [ 1 ]

Se ha descubierto que los niveles de ctDNA en plasma se correlacionan significativamente con el volumen del tumor en comparación con las imágenes médicas (TC, PET y RM)., [ 1 ] [ 14 ] [ 17 ] [ 18 ] La detección de ctDNA puede predecir el tumor residual o la recidiva inminente, en algunos casos incluso mejor que las imágenes médicas y los métodos actuales.

Indicador pronóstico

Se ha demostrado que la detección de ADN tumoral circulante (ADNtc) predice la recaída en múltiples estudios. En un estudio [ 14 ] sobre cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) en estadio avanzado, se encontraron dos casos en los que el ADNtc predijo correctamente el pronóstico del paciente cuando las imágenes médicas eran erróneas. En un caso, las imágenes predijeron la recaída basándose en un tumor residual sospechoso que resultó ser solo inflamación inducida por radiación, pero no se detectó ADNtc y el paciente no recayó. En otro caso, las imágenes no mostraron tumor, pero se detectó ADNtc y el paciente recayó poco después. En otro estudio [ 18 ] sobre linfoma difuso de células B grandes (LDCBG), también se encontró que el ADNtc predice la recaída.

Genotipado de tumores sin biopsia

Las biopsias son invasivas y conllevan riesgos para el paciente. Por lo tanto, las biopsias múltiples para monitorizar la progresión de la enfermedad son poco frecuentes y se recurre a las biopsias diagnósticas para obtener información genética. Esto puede resultar problemático debido a la heterogeneidad y evolución tumoral. En primer lugar, las biopsias solo toman una muestra de una porción del tumor, y dado que los tumores son heterogéneos, esto no abarca el panorama genético completo del tumor. En segundo lugar, tras el tratamiento, los tumores evolucionan y pueden aparecer nuevas mutaciones no representadas en la muestra diagnóstica. [ 1 ] [ 14 ]

La genotipificación tumoral sin biopsia, mediante CAPP-Seq y ctDNA, aborda muchos de estos problemas. Un simple análisis de sangre es no invasivo, mucho más seguro y fácil de realizar a los pacientes con cáncer varias veces durante el tratamiento. El uso de ctDNA proporciona una muestra de ADN tumoral más completa que la obtenida mediante biopsia, lo que permite una mejor estimación de la heterogeneidad tumoral. La toma de múltiples muestras de ctDNA en diferentes momentos durante el tratamiento permite descubrir la evolución del tumor. Esto puede ayudar a detectar la aparición de mutaciones que confieren resistencia a la terapia dirigida y permite ajustar el tratamiento en consecuencia. CAPP-Seq permite específicamente el análisis de múltiples localizaciones genómicas, lo que será fundamental a medida que aumente la lista de mutaciones cancerígenas relevantes para el tratamiento. [ 14 ] En un estudio [ 1 ] sobre cáncer de pulmón de células no pequeñas en estadio avanzado, realizaron una versión de CAPP-Seq en la que no se secuenció previamente la biopsia tumoral, y lograron clasificar correctamente el 100 % de las muestras de plasma de los pacientes con una tasa de falsos positivos del 0 %. Esto demuestra que, incluso sin conocimiento previo de las mutaciones tumorales, estas pueden detectarse con precisión únicamente mediante el ADN tumoral circulante (ctDNA).

Referencias

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