CLARIDAD

CLARITY ^{[ 1 ]} es un método para hacer transparente el tejido usando hidrogeles a base de acrilamida construidos desde dentro del tejido y unidos a él, y como se define en el artículo inicial, representa "la transformación de tejido biológico intacto en una forma híbrida en la que componentes específicos se reemplazan con elementos exógenos que proporcionan nueva accesibilidad o funcionalidad". ^{[ 1 ]} Cuando se combina con el marcaje basado en anticuerpos o genes, CLARITY permite obtener imágenes muy detalladas de la estructura de proteínas y ácidos nucleicos de los órganos, especialmente del cerebro . Fue desarrollado por Kwanghun Chung y Karl Deisseroth en la Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford . ^{[ 2 ]}

Varios artículos publicados han aplicado el método CLARITY a una amplia gama de tejidos y estados patológicos, como la inmuno-oncología para el cáncer de mama humano, ^{[ 3 ]} cerebros humanos con enfermedad de Alzheimer , ^{[ 4 ]} médulas espinales de ratones, ^{[ 5 ]} modelos animales de esclerosis múltiple , ^{[ 6 ]} y plantas. ^{[ 7 ]} CLARITY también se ha combinado con otras tecnologías para desarrollar nuevos métodos de microscopía, incluyendo la microscopía de expansión confocal , la microscopía de lámina de luz SPIM y la microscopía de lámina de luz optimizada por CLARITY (COLM). ^{[ 8 ]}

El proceso de aplicación de la imagen CLARITY comienza con una muestra de tejido post mortem . Dependiendo del tipo de tejido, pueden ser necesarios pasos de preprocesamiento, como la desmineralización o la decoloración, después de la fijación de la muestra. A continuación, se debe aplicar una serie de tratamientos químicos para lograr la transparencia, en los que se elimina el contenido lipídico de la muestra, mientras que casi todas las proteínas y ácidos nucleicos originales permanecen intactos. ^{[ 1 ]} El propósito de esto es hacer que el tejido sea transparente y, por lo tanto, apto para una investigación microscópica detallada de sus partes funcionales constituyentes (que son predominantemente proteínas y ácidos nucleicos). Para lograr esto, la estructura proteica preexistente debe colocarse en un andamiaje transparente que la preserve, mientras que los componentes lipídicos se eliminan. Este andamiaje está compuesto de monómeros de hidrogel como la acrilamida. La adición de moléculas como formaldehído , paraformaldehído o glutaraldehído puede facilitar la unión del andamiaje a las proteínas y ácidos nucleicos que se van a preservar, y la aplicación de calor es necesaria para establecer los enlaces reales entre los componentes celulares y la acrilamida. ^{[ 9 ]}

Una vez completado este paso, los componentes de proteínas y ácidos nucleicos de las células del tejido diana se mantienen firmemente en su lugar, mientras que los componentes lipídicos permanecen separados. Los lípidos se eliminan a lo largo de días o semanas mediante difusión pasiva en detergente, o se acelera el proceso mediante métodos electroforéticos en tan solo horas o días. ^{[ 10 ] [ 11 ]} Los intentos de acelerar el proceso mediante métodos electroforéticos siguen siendo inconclusos en cuanto a su capacidad para evitar daños en el tejido. A medida que pasan, las propiedades lipofílicas del detergente le permiten recoger y eliminar cualquier lípido encontrado en el camino. Los colorantes lipofílicos como el DiI se eliminan; sin embargo, existen colorantes lipofílicos compatibles con CLARITY que pueden fijarse a las proteínas vecinas. ^{[ 12 ]} La gran mayoría de las moléculas no lipídicas, como las proteínas y el ADN, no se ven afectadas por este procedimiento, gracias al gel de acrilamida y a las propiedades químicas de las moléculas involucradas. ^{[ 9 ]}

Como se informó en el artículo inicial, el tejido se expande durante este proceso, pero, si es necesario, puede volver a sus dimensiones iniciales con un paso final de incubación en una solución con índice de refracción similar. ^{[ 1 ]} La expansión del tejido ocurre en el cerebro, que es particularmente rico en lípidos; sin embargo, se ha observado que otros tipos de tejido no experimentan tanta expansión durante el proceso.

En esta etapa del proceso, la muestra ya está completamente preparada para la obtención de imágenes. El contraste para la obtención de imágenes puede provenir de moléculas fluorescentes endógenas, de marcadores de ácidos nucleicos (ADN o ARN) o de inmunotinción , en la que se utilizan anticuerpos que se unen específicamente a una sustancia diana determinada. Además, estos anticuerpos están marcados con etiquetas fluorescentes que son clave para el resultado final de la imagen. Los métodos estándar de imagen confocal, de dos fotones o de lámina de luz son adecuados para detectar la fluorescencia emitida hasta la escala de localización de la proteína, lo que da como resultado las imágenes tridimensionales y de alta resolución que produce CLARITY. ^{[ 9 ]}

Después de que una muestra ha sido sometida a inmunotinción para obtener una imagen, es posible eliminar los anticuerpos y volver a aplicar otros nuevos, lo que permite obtener imágenes de una muestra varias veces y analizar múltiples tipos de proteínas. ^{[ 13 ] [ 14 ]}

En términos de neuroimagen, la capacidad de la técnica CLARITY para revelar estructuras específicas con un detalle tan nítido ha dado lugar a prometedoras vías para futuras aplicaciones, incluyendo el cableado de circuitos locales (especialmente en relación con el Proyecto Conectoma ), las relaciones entre células neuronales, las funciones de las estructuras subcelulares, una mejor comprensión de los complejos proteicos y la obtención de imágenes de ácidos nucleicos y neurotransmisores . ^{[ 1 ]} Un ejemplo de un descubrimiento realizado mediante la técnica CLARITY es un peculiar patrón en forma de "escalera" donde las neuronas se conectan entre sí y con sus vecinas, lo que se ha observado en animales y se ha relacionado con comportamientos similares al autismo . ^{[ 15 ]}

La técnica CLARITY se ha extendido a diversas aplicaciones más allá del cerebro. ^{[ 16 ]} Se han publicado numerosas modificaciones para desarrollar las publicaciones iniciales y se han realizado esfuerzos tanto en el ámbito académico como en la industria biotecnológica para aplicar aplicaciones de amplio alcance a CLARITY. CLARITY continúa ganando terreno como una tecnología emergente que puede proporcionar información valiosa para el diagnóstico clínico en el futuro. CLARITY se puede utilizar con pocas o ninguna modificación para limpiar la mayoría de los demás órganos, como el hígado, el páncreas, el bazo, los testículos y los ovarios, y otras especies como el pez cebra. Si bien el hueso requiere un simple paso de descalcificación, de manera similar, el tejido vegetal requiere una degradación enzimática de la pared celular . ^{[ 10 ]}

El director de los NIH, Francis Collins, ya ha expresado sus esperanzas puestas en esta tecnología emergente, diciendo: ^{[ 17 ]}

"CLARITY es una herramienta poderosa. Permitirá a los investigadores estudiar enfermedades y trastornos neurológicos, centrándose en las estructuras afectadas o dañadas sin perder la perspectiva global. Esto es algo que nunca antes habíamos podido hacer en tres dimensiones."

Aunque el procedimiento CLARITY ha alcanzado niveles sin precedentes de retención de proteínas después de la extracción de lípidos, la técnica aún pierde aproximadamente un 8 % de proteínas por cada instancia de electroforesis con detergente. ^{[ 13 ]} La obtención de imágenes repetidas de una sola muestra solo amplificaría esta pérdida, ya que la eliminación de anticuerpos se realiza comúnmente mediante el mismo proceso de detergente que crea la muestra original. ^{[ 9 ]} Sin embargo, esos cálculos parecen carecer de un método consistente para la pérdida total de proteínas a lo largo del experimento. ClearLight Biotechnologies, una empresa fundada por Karl Deisseroth, descubrió que el proceso de detergente publicado originalmente para la eliminación de anticuerpos no era el enfoque ideal y ha desarrollado una solución de decoloración que no es tan perjudicial para la integridad del tejido.

Otras posibles desventajas de la técnica son el tiempo que lleva crear y obtener imágenes de una muestra (solo la tinción inmunohistoquímica tarda hasta seis semanas en realizarse), y el hecho de que la acrilamida utilizada es altamente tóxica y carcinogénica . El tiempo se ha citado a menudo como un factor limitante y una desventaja para el uso de la técnica CLARITY; sin embargo, varias empresas académicas y biotecnológicas (Logos Bioscience, ClearLight Biotechnologies) han continuado desarrollando y optimizando reactivos CLARITY que acortaron significativamente el marco de tiempo de inmunotinción reduciendo el proceso de seis semanas a tan solo una semana dependiendo del tipo de muestra. Todos los aclaramientos de tejidos tienen sus propios problemas de seguridad. Si bien la acrilamida se considera tóxica y carcinogénica, sus componentes son similares a los que se encuentran en los geles utilizados para los western blots.

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