3DISCO

Las muestras biológicas (tejidos) son estructuras heterogéneas compuestas por compuestos con índices de refracción diferentes. Por ejemplo, el agua tiene un índice de refracción de 1,33, mientras que los lípidos y las proteínas tienen índices de refracción de entre 1,40 y 1,45. ^{[ 19 ]} Como resultado, la luz se dispersa al atravesar el tejido, lo que provoca una disminución de la resolución o incluso la desaparición de la señal en muestras de más de unas pocas decenas de micrómetros de espesor. Por lo tanto, una serie de pasos que incluyen la deshidratación y deslipidación del tejido, seguida de su incubación y posterior obtención de imágenes en un medio con un índice de refracción similar al de las estructuras a analizar, disminuye la dispersión de la luz y da como resultado una muestra transparente. ^{[ 20 ] [ 21 ]}

Después de la fijación (generalmente con paraformaldehído ) y el posterior marcaje con colorantes, las muestras se deshidratan mediante incubación en soluciones con concentración creciente (50%, 70%, 80% y 100% en agua) de tetrahidrofurano ( THF ). Debido a la ausencia de grupos reactivos como alcohol, aldehído o cetona, el THF es menos reactivo y conserva mejor la fluorescencia que otras soluciones deshidratantes. ^{[ 21 ] [ 18 ]} Tras la deshidratación, la muestra se enjuaga primero en diclorometano (DCM) y finalmente en éter dibencílico (DBE) para igualar el índice de refracción del tejido y del medio circundante, obteniendo así una muestra transparente. En DBE, las muestras también se almacenan y se les realiza la imagen. ^{[ 1 ]}

El protocolo 3DISCO es el más adecuado para tejidos fijados marcados con fluoróforos fuertes, idealmente modelos transgénicos que expresan proteínas fluorescentes como la GFP (alternativamente, también es posible la tinción con colorantes sintéticos). ^{[ 21 ]} Para el marcaje con anticuerpos, el método 3DISCO se optimizó y publicó con el nombre iDISCO (véase más abajo Modificaciones y aplicaciones). ^{[ 10 ]}

Todo el proceso es relativamente fácil de realizar y solo requiere cambios en las soluciones dadas, sin necesidad de equipos de laboratorio personalizados. El proceso de aclaramiento y posterior obtención de imágenes es rápido (de horas a días, dependiendo del tamaño de la muestra), especialmente en comparación con el seccionamiento físico de un órgano completo, la obtención de imágenes de sus partes y la reconstrucción antes del análisis de imágenes posterior (que fácilmente podría llevar varias semanas). ^{[ 1 ] [ 21 ]} Además, 3DISCO funciona en muchos tipos de tejidos (pulmón, bazo, ganglios linfáticos, glándula mamaria , tumores). ^{[ 1 ] [ 10 ]}

Los principales inconvenientes de este método son la deslipidación parcial del tejido durante la aclaración, el uso selectivo de colorantes lipofílicos, la contracción del tejido durante la aclaración, ^{[ 21 ]} la degradación parcial de la fluorescencia, ^{[ 22 ]} la degradación completa de la fluorescencia durante el almacenamiento a largo plazo ^{[ 1 ]} y la toxicidad de los reactivos usados ​​(y su potencial para dañar los objetivos de microscopía si se filtran de la cámara de imagen). ^{[ 23 ]}

El método 3DISCO fue adoptado poco después de su publicación por otros investigadores y modificado con el objetivo de alcanzar metas específicas, como el uso de marcaje retrógrado ^{[ 24 ] [ 25 ]} o con anticuerpos ( iDISCO ), ^{[ 10 ]} la clarificación del cuerpo entero del ratón ( uDISCO ) ^{[ 3 ]} o la clarificación de muestras fijadas con formalina e incluidas en parafina (DIPCO). ^{[ 8 ]}

Los autores de iDISCO (acrónimo de "imágenes de órganos aclarados con solventes mediante inmunomarcaje") incluyeron un pretratamiento de la muestra con metanol, peróxido de hidrógeno, detergentes y dimetilsulfóxido (DMSO), junto con el marcaje con anticuerpos antes del aclaramiento. Este preprocesamiento supera dos inconvenientes del marcaje con anticuerpos de muestras grandes: primero, reduce la autofluorescencia de las muestras y mejora la relación señal-ruido; y segundo, facilita la penetración de los anticuerpos en el tejido. Como resultado, muestras tan grandes como embriones de ratón u órganos completos de ratón pueden teñirse con éxito con anticuerpos marcados con fluorescencia y, posteriormente, aclararse y visualizarse. ^{[ 10 ]}

Los autores de uDISCO (de "ultimate imaging of solvent-cleared organs") mejoran la contracción del tejido, un efecto secundario común de la deshidratación de la muestra en el primer paso de la clarificación. Utilizaron terc-butanol en lugar de THF para la deshidratación y también una solución diferente para la obtención de imágenes, que preserva mejor la fluorescencia que DBE. Gracias a la contracción del tejido, pueden observar muestras grandes, hasta del tamaño del cuerpo entero de un ratón. ^{[ 3 ]} Cabe mencionar que uDISCO fue destacado por medios de comunicación de todo el mundo, incluyendo el New York Times, ^{[ 26 ]} el Wall Street Journal, ^{[ 27 ]} Business Insider, ^{[ 28 ]} Nature y Science ^{[ 29 ]} revistas. También fue elegido como una de las 10 mejores imágenes científicas de 2016 por Nature. ^{[ 30 ]}

DIPCO (de "diagnosing immunolabelled paraffin-embedded cleared organs") es un proceso que combina la desparafinización de muestras tumorales incluidas en parafina fijada en formalina e incluida en parafina (FFPE), la clarificación iDISCO y la fenotipificación del tejido tumoral. Las muestras tumorales FFPE se almacenan ampliamente en biobancos y se utilizan para diagnóstico, y su análisis 3D podría ayudar a mejorar la estratificación de los pacientes con cáncer. ^{[ 8 ]}

Los métodos de aclaramiento, incluido 3DISCO, se desarrollaron principalmente para la investigación en neurociencia . La razón es la alta complejidad morfológica y funcional del sistema nervioso , cuya investigación es larga y laboriosa con los métodos histológicos clásicos. ^{[ 21 ] [ 31 ]} Por lo tanto, la mayoría de los estudios se centran en el sistema nervioso central del ratón (los roedores son uno de los principales organismos modelo para la neurobiología). Los autores del método 3DISCO lo utilizaron primero para estudiar la regeneración en el sistema nervioso central (SNC) del ratón, incluyendo el recuento de microglia , astrocitos y el mapeo de trayectorias de axones después de una lesión. ^{[ 2 ]} 3DISCO también se utilizó para mapear el desarrollo del SNC del ratón. ^{[ 2 ]} Su modificación iDISCO se utilizó para estudios funcionales de la actividad cerebral ^{[ 10 ]} o para mapear placas amiloides , microglia, vasculatura y otras propiedades de los cerebros en pacientes con enfermedad de Alzheimer y modelos de ratón. ^{[ 32 ]} Posteriormente se utilizó la modificación uDISCO para el mapeo de células individuales de neuronas en el SNC completo sin seccionar del ratón.

En los últimos años, el uso de los métodos "DISCO" se ha ampliado a la investigación de muchos otros tejidos, incluyendo el mapeo de células individuales de células madre trasplantadas en órganos completos de ratones, ^{[ 3 ]} la obtención de imágenes de embriones humanos completos en diferentes etapas de desarrollo ^{[ 11 ]} o el examen y diagnóstico de tejido tumoral humano. ^{[ 8 ]}