Activación CRISPR

La Cas9 Endonucleasa Muerta, también conocida como Cas9 muerta o dCas9 , es una forma mutante de Cas9 cuya actividad endonucleasa se elimina mediante mutaciones puntuales en sus dominios endonucleasa. Al igual que su forma no mutada, la dCas9 se utiliza en sistemas CRISPR junto con ARN guía para dirigir genes o nucleótidos específicos complementarios al ARN guía con secuencias PAM que permiten la unión de Cas9. Normalmente, Cas9 tiene dos dominios endonucleasa llamados dominios RuvC y HNH. Las mutaciones puntuales D10A y H840A modifican dos residuos importantes para la actividad endonucleasa, lo que finalmente resulta en su desactivación. Aunque la dCas9 carece de actividad endonucleasa, aún es capaz de unirse a su ARN guía y a la cadena de ADN objetivo, ya que dicha unión está gestionada por otros dominios. Esto por sí solo suele ser suficiente para atenuar, si no bloquear por completo, la transcripción del gen diana si el ARN guía posiciona la dCas9 de manera que impida que los factores de transcripción y la ARN polimerasa accedan al ADN. Sin embargo, esta capacidad de unión al ADN también puede aprovecharse para la activación, ya que la dCas9 posee regiones modificables, generalmente los extremos N y C de la proteína, que pueden utilizarse para unir activadores transcripcionales. ^{[ 3 ]}

Ver: ARN guía , CRISPR

Un ARN guía pequeño ( sgRNA ), o gRNA, es un ARN de aproximadamente 20 nucleótidos que se utiliza para dirigir Cas9 o dCas9 a sus dianas. Los gRNA contienen dos regiones principales de importancia para los sistemas CRISPR: la región de andamiaje y la región espaciadora. La región espaciadora tiene nucleótidos complementarios a los que se encuentran en los genes diana, a menudo en la región promotora . La región de andamiaje es responsable de la formación de un complejo con (d)Cas9. Juntos, se unen a (d)Cas9 y lo dirigen al gen o genes de interés. Dado que la región espaciadora de un gRNA puede modificarse para cualquier secuencia potencial, proporciona a los sistemas CRISPR mucha más flexibilidad, ya que cualquier gen y nucleótido con una secuencia complementaria a la región espaciadora puede convertirse en una diana posible. ^{[ 3 ]}

Ver: Activador transcripcional , Factor de transcripción

Los activadores transcripcionales son dominios proteicos o proteínas completas unidas a dCas9 o sgRNA que ayudan a reclutar cofactores importantes, así como la ARN polimerasa, para la transcripción del gen o genes diana del sistema. Para que se produzca una proteína a partir del gen que la codifica, la ARN polimerasa debe sintetizar ARN a partir del ADN molde del gen durante un proceso llamado transcripción. Los activadores transcripcionales poseen un dominio de unión al ADN y un dominio de activación de la transcripción. El dominio de activación puede reclutar factores de transcripción generales o la ARN polimerasa a la secuencia genética. Los dominios de activación también pueden funcionar facilitando la transcripción por parte de las ARN polimerasas detenidas y, en eucariotas , pueden actuar moviendo nucleosomas en el ADN o modificando histonas para aumentar la expresión génica. ^{[ 4 ]} Estos activadores pueden introducirse en el sistema mediante su unión a dCas9 o al sgRNA. Algunos investigadores han observado que el grado de regulación positiva transcripcional puede modularse utilizando múltiples sitios para la unión de activadores en un experimento y utilizando diferentes variaciones y combinaciones de activadores a la vez en un experimento o muestra determinados. ^{[ 5 ] [ 6 ] [ 7 ]}

Se requiere un sistema de expresión para introducir los ARN guía (gRNA) y las proteínas (d)Cas9 en las células de interés. Las opciones más utilizadas incluyen, entre otras, plásmidos y vectores virales como el virus adenoasociado (AAV) o el lentivirus .

El activador dCas9 VP64-p65-Rta, o VPR, se creó modificando un activador dCas9 existente, en el que se une un activador transcripcional Vp64 al extremo C de dCas9. ^{[ 1 ]} En la proteína dCas9-VPR, los factores de transcripción p65 y Rta se añaden al extremo C de dCas9-Vp64. Por lo tanto, los tres factores de transcripción se dirigen al mismo gen. El uso de tres factores de transcripción, en lugar de solo Vp64, da como resultado una mayor expresión de los genes diana. Cuando se dirigieron diferentes genes con dCas9, todos mostraron una expresión significativamente mayor con dCas9-VPR que con dCas9-VP64. También se ha demostrado que dCas9-VPR puede utilizarse para aumentar la expresión de múltiples genes dentro de la misma célula mediante la introducción de múltiples sgRNA en la misma célula. ^{[ 8 ]}

dCas9-VPR se ha utilizado para activar los genes NEUROG2 y NEUROD1 , lo que resulta en la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas en neuronas inducidas . ^{[ 8 ]} Un estudio que comparó activadores de dCas9 encontró que los activadores VPR, SAM y Suntag funcionaron mejor con dCas9 para aumentar la expresión génica en una variedad de tipos de células de mosca de la fruta , ratón y humanas . ^{[ 9 ]}

Para superar las limitaciones del sistema de activación génica dCas9-VP64, se desarrolló el sistema dCas9-SAM, que incorpora múltiples factores de transcripción. Mediante las proteínas MS2 , p65 y HSF1 , el sistema dCas9-SAM recluta diversos factores de transcripción que actúan sinérgicamente para activar el gen de interés.

Para ensamblar diferentes activadores transcripcionales, el sistema dCas9-SAM utiliza un ARN guía simple (sgRNA) modificado que posee sitios de unión para la proteína MS2. Se unen aptámeros en horquilla al bucle tetraédrico y al bucle tallo 2 del sgRNA para que actúen como sitios de unión para las proteínas de la cápside del bacteriófago MS2 dimerizadas . Dado que las horquillas se encuentran expuestas fuera del complejo dCas9-sgRNA, otros factores de transcripción pueden unirse a la proteína MS2 sin alterar dicho complejo. De esta forma, la proteína MS2 se modifica genéticamente para incluir las proteínas p65 y HSF1. La proteína de fusión MS2-p65-HSF1 interactúa con dCas9-VP64 para reclutar más factores de transcripción al promotor de los genes diana.

Utilizando el sistema dCas9-SAM, Konermann et al. (2015) identificaron genes en células de melanoma que confieren resistencia a un inhibidor de BRAF . ^{[ 7 ]} En otro estudio, Zhang et al. (2015) emplearon el sistema dCas-SAM en líneas celulares humanas para reactivar el provirus latente del VIH , desencadenando la apoptosis de las células infectadas. ^{[ 10 ]}

El sistema activador SunTag utiliza la proteína dCas9, la cual se modifica para unirse al SunTag. El SunTag es una secuencia repetitiva de polipéptidos que puede reclutar múltiples copias de anticuerpos . Al unir factores de transcripción a los anticuerpos, el complejo activador SunTag-dCas9 amplifica el reclutamiento de estos factores. Para guiar la proteína dCas9 hacia su gen diana, el sistema dCas9-SunTag utiliza sgRNA .

Tanenbaum et al. (2014) son reconocidos por crear el sistema dCas9 SunTag. ^{[ 11 ]} Para los anticuerpos , emplearon anticuerpos GCN4 que se unieron al factor de transcripción VP64. Para transportar los anticuerpos a los núcleos de las células, añadieron una etiqueta NLS . Para confirmar la localización nuclear de los anticuerpos, se utilizó sfGFP para su visualización. Por lo tanto, se desarrolló la proteína GCN4-sfGFP-NLS-VP64 para interactuar con el sistema dCas SunTag. Los anticuerpos se unieron con éxito a los polipéptidos SunTag y activaron el gen diana CXCR4 en líneas celulares K562. ^{[ 11 ]} En comparación con el complejo de activación dCas9-VP64, lograron aumentar la expresión del gen CXCR4 de 5 a 25 veces en líneas celulares K562. No solo hubo una mayor sobreexpresión de la proteína CXCR4, sino que también las proteínas CXCR4 fueron activas para viajar más en el ensayo de migración transwell. De este modo, el sistema dCas9-SunTag puede utilizarse para activar genes que se encuentran presentes de forma latente, como los genes de los virus.

Un grupo de investigación utilizó un sistema en el que dCas9 se fusionó a un dominio particular, C1B1. Cuando se ilumina la célula con luz azul, el dominio criptocromo 2 (Cry2) se une a C1B1. El dominio Cry2 está fusionado a un activador transcripcional , por lo que la luz azul dirige el activador al lugar donde se encuentra unido dCas9. El uso de la luz permite un gran control sobre el momento en que se activa el gen objetivo. Al retirar la luz de la célula, solo queda dCas9 en el gen objetivo, por lo que la expresión no aumenta. De esta manera, el sistema es reversible. ^{[ 13 ]} Se desarrolló un sistema similar utilizando control químico. En este sistema, dCas9 recluta una proteína de fusión MS2 que contiene el dominio FKBP. En presencia del compuesto químico RAP, un dominio FRB fusionado a un complejo modificador de la cromatina se une a FKBP. Cada vez que se añade RAP a las células, un complejo modificador de la cromatina específico puede dirigirse al gen. Esto permite a los científicos examinar cómo las modificaciones específicas de la cromatina afectan la expresión de un gen. ^{[ 14 ]} El sistema dCas9-VPR se utiliza como activador al dirigirlo al promotor de un gen aguas arriba de la región codificante. Un estudio utilizó varios sgRNA para dirigirse a diferentes porciones del gen, encontrando que el activador dCas9-VPR puede actuar como activador o represor, dependiendo de la ubicación a la que se une. En una célula, los sgRNA dirigidos al promotor podrían permitir que dCas9-VPR aumente la expresión, mientras que los sgRNA dirigidos a la región codificante del gen dan como resultado que dCas9-VPR disminuya la expresión. ^{[ 15 ]}

La versatilidad de los sgRNA permite que los activadores de dCas9 aumenten la expresión de cualquier gen dentro del genoma de un organismo. Esto podría usarse para aumentar la expresión de un gen codificante de proteínas o un ARN transcrito. Un artículo demostró que la activación a nivel genómico podría usarse para determinar qué proteínas están involucradas en la resistencia mediada a un fármaco específico. ^{[ 7 ]} Otro artículo usó la activación a nivel genómico de ARN largos no codificantes y observó que el aumento de la expresión de ciertos ARN largos no codificantes confería resistencia al fármaco vemurafenib . ^{[ 16 ]} En ambos casos, las células que sobreviven al fármaco podrían estudiarse para determinar qué sgRNA contienen. Esto permite a los investigadores determinar qué gen se activó en cada célula superviviente, lo que sugiere qué genes son importantes para la resistencia a ese fármaco.

Una fusión de dCas9 con VP64, p65 y HSF1 (factor de choque térmico 1) permitió a los investigadores dirigir genes en Arabidopsis thaliana y aumentar la transcripción a un nivel similar al que se obtiene al insertar el gen directamente en el genoma de la planta. En uno de los dos genes analizados, el activador dCas9 modificó el número y el tamaño de las hojas y mejoró la capacidad de las plantas para tolerar la sequía. Los autores concluyen que el activador dCas9 puede generar fenotipos en plantas similares a los observados al insertar un transgén para su sobreexpresión. ^{[ 17 ]} Los investigadores utilizaron múltiples ARN guía para dirigir el sistema de activación de dCas9 a múltiples genes en una cepa específica de ratón, en la que dCas9 puede activarse en líneas celulares específicas mediante el sistema de recombinasa Cre . Los científicos utilizaron la focalización y el aumento de la expresión de varios genes para examinar los procesos implicados en la regeneración y los carcinomas hepáticos . ^{[ 18 ]}