Interferencia CRISPR

CRISPRi puede reprimir estéricamente la transcripción bloqueando la iniciación o la elongación transcripcional. Esto se logra diseñando sgRNA complementario al promotor o a las secuencias exónicas . El nivel de represión transcripcional con un objetivo dentro de la secuencia codificante es específico de la hebra. Dependiendo de la naturaleza del efector CRISPR, la hebra molde o la no molde conduce a una represión más fuerte. ^{[ 14 ]} Para dCas9 (basado en un sistema CRISPR de tipo 2), la represión es más fuerte cuando el ARN guía es complementario a la hebra no molde. Se ha sugerido que esto se debe a la actividad de la helicasa, que desenrolla el heterodúplex ARN:ADN delante de la ARN polimerasa II cuando el sgRNA es complementario a la hebra molde. A diferencia del bloqueo de la elongación de la transcripción, el silenciamiento es independiente de la hebra de ADN objetivo cuando se dirige al sitio de inicio de la transcripción. En procariotas, esta inhibición estérica puede reprimir la transcripción del gen objetivo en casi un 99,9%; En arqueas, se logró una represión de más del 90%; ^{[ 15 ]} en células humanas, se observó una represión de hasta el 90%. ^{[ 2 ]} En bacterias, es posible saturar el objetivo con un nivel suficientemente alto del complejo dCas9. En este caso, la fuerza de represión solo depende de la probabilidad de que dCas9 sea expulsado al colisionar con la ARN polimerasa, que está determinada por la secuencia guía. ^{[ 16 ]} Las temperaturas más altas también se asocian con una mayor probabilidad de expulsión, por lo tanto, una represión más débil. ^{[ 16 ]} En eucariotas, CRISPRi también puede reprimir la transcripción a través de un dominio efector. La fusión de un dominio represor a dCas9 permite que la transcripción se reprima aún más al inducir la heterocromatinización. Por ejemplo, el dominio KRAB ( Krüppel associated box ), bien estudiado, puede fusionarse a dCas9 para reprimir la transcripción del gen objetivo hasta en un 99% en células humanas. ^{[ 17 ]}

Mientras que la edición del genoma mediante la nucleasa Cas9 catalíticamente activa puede ir acompañada de alteraciones genómicas irreversibles fuera del objetivo, CRISPRi es altamente específico con mínimos efectos reversibles fuera del objetivo para dos secuencias de sgRNA distintas. ^{[ 17 ]} No obstante, se han desarrollado varios métodos para mejorar la eficiencia de la modulación transcripcional. La identificación del sitio de inicio de la transcripción de un gen objetivo y la consideración de las preferencias del sgRNA mejoran la eficiencia, al igual que la presencia de cromatina accesible en el sitio objetivo. ^{[ 18 ]}

Se ha demostrado que una porción significativa del genoma (tanto genes reporteros como endógenos) en eucariotas puede ser modificada mediante construcciones lentivirales para expresar dCas9 y sgRNAs, con una eficiencia comparable a la de técnicas existentes como RNAi y proteínas TALE. ^{[ 17 ]} En tándem o como sistema independiente, CRISPRi podría utilizarse para lograr las mismas aplicaciones que en RNAi.

Para bacterias, la inactivación génica mediante CRISPRi se ha implementado y caracterizado completamente (análisis fuera de objetivo, represión con fugas) tanto para la bacteria Gram-negativa E. coli ^{[ 4 ] [ 6 ]} como para la bacteria Gram-positiva B. subtilis . ^{[ 5 ]}

CRISPRi-Cas9 se utilizó con éxito no solo en bacterias sino también en arqueas (por ejemplo, M. acetivorans), ya que eliminó eficazmente varios genes/operones relacionados con la fijación de nitrógeno. ^{[ 15 ]}

La expresión génica diferencial puede lograrse modificando la eficiencia del apareamiento de bases del sgRNA con los loci objetivo. ^{[ 12 ]} En teoría, la modulación de esta eficiencia puede utilizarse para crear una serie alélica para cualquier gen dado, creando esencialmente una colección de hipomorfos e hipermorfos. Estas poderosas colecciones pueden utilizarse para explorar cualquier investigación genética. Para los hipomorfos , esto permite la reducción incremental de la función génica en contraposición a la naturaleza binaria de los knockouts génicos y la imprevisibilidad de los knockdowns. Para los hipermorfos , esto contrasta con el método convencional de clonar el gen de interés bajo promotores con fuerza variable.

La fusión de una proteína fluorescente a dCas9 permite la visualización de loci genómicos en células humanas vivas. ^{[ 19 ]} En comparación con la hibridación fluorescente in situ (FISH), este método permite, de forma única, el seguimiento dinámico de los loci cromosómicos. Se ha utilizado para estudiar la arquitectura de la cromatina y la dinámica de la organización nuclear en líneas celulares de laboratorio, incluidas las células HeLa.

La activación de los factores de Yamanaka mediante CRISPRa se ha utilizado para inducir pluripotencia en células humanas y de ratón, proporcionando un método alternativo a la tecnología iPS. ^{[ 20 ] [ 21 ]} Además, se podrían utilizar cribados de activación a gran escala para identificar proteínas que promuevan la pluripotencia inducida o, por el contrario, promuevan la diferenciación hacia un linaje celular específico. ^{[ 22 ]}

La capacidad de aumentar la expresión génica mediante dCas9-SunTag con un único sgRNA también abre la puerta a cribados genéticos a gran escala, como Perturb-seq , para descubrir fenotipos que resultan del aumento o la disminución de la expresión génica, lo cual será especialmente importante para comprender los efectos de la regulación génica en el cáncer. ^{[ 23 ]} Además, se ha demostrado que los sistemas CRISPRi son transferibles mediante mecanismos de transferencia horizontal de genes, como la conjugación bacteriana , y se ha demostrado la represión específica de genes reporteros en células receptoras. CRISPRi podría servir como herramienta para el cribado genético y, potencialmente, para el control de poblaciones bacterianas. ^{[ 24 ]}

1. CRISPRi puede silenciar un gen diana de interés con una represión de hasta el 99,9 %. ^{[ 12 ]} La intensidad de la represión también puede ajustarse modificando el grado de complementariedad entre el ARN guía y la diana. A diferencia de los promotores inducibles, la represión parcial mediante CRISPRi no añade ruido transcripcional a la expresión de la diana. ^{[ 16 ]} Dado que el nivel de represión está codificado en una secuencia de ADN, se pueden cultivar diversos niveles de expresión en competencia e identificarlos mediante secuenciación. ^{[ 25 ]}
2. Dado que CRISPRi se basa en el apareamiento de bases de Watson-Crick entre el ARN guía y el ADN, y en un motivo PAM NGG, la selección de sitios diana dentro del genoma es sencilla y flexible. Se han desarrollado protocolos cuidadosamente definidos. ^{[ 12 ]}
3. Se pueden utilizar múltiples sgRNA no solo para controlar varios genes diferentes simultáneamente (CRISPRi multiplex), sino también para mejorar la eficiencia de la regulación del mismo gen objetivo.
4. Si bien ambos sistemas pueden ser complementarios, CRISPRi ofrece ventajas sobre la ARN interferencia (ARNi). Al ser un sistema exógeno, CRISPRi no compite con la maquinaria endógena, como la expresión o la función de los microARN. Además, dado que CRISPRi actúa a nivel del ADN, permite dirigir la acción a transcritos como ARN no codificantes, microARN, transcritos antisentido, ARN localizados en el núcleo y transcritos de la polimerasa III. Finalmente, CRISPRi posee un espacio de secuencias diana mucho mayor; también se pueden dirigir a promotores y, en teoría, intrones. ^{[ 17 ]}
5. En E. coli , la construcción de una cepa con silenciamiento génico es extremadamente rápida y requiere solo un paso de recombinación de oligonucleótidos . ^{[ 6 ]}

1. El requisito de una secuencia de motivo adyacente al protoespaciador (PAM) limita el número de secuencias diana potenciales. Cas9 y sus homólogos pueden usar diferentes secuencias PAM y, por lo tanto, teóricamente podrían utilizarse para ampliar el número de secuencias diana potenciales. ^{[ 12 ]}
2. La especificidad de secuencia para los loci objetivo es de solo 14 nt de longitud (12 nt de sgRNA y 2 nt de PAM), que puede repetirse unas 11 veces en un genoma humano. ^{[ 12 ]} La represión está inversamente correlacionada con la distancia del sitio objetivo al sitio de inicio de la transcripción. Las predicciones computacionales a nivel genómico o la selección de homólogos de Cas9 con un PAM más largo pueden reducir la focalización inespecífica.
3. Los estados y modificaciones endógenas de la cromatina pueden impedir la unión secuencia-específica del complejo dCas9-sgRNA. ^{[ 12 ]} El nivel de represión transcripcional en células de mamíferos varía entre genes. Se necesita mucho trabajo para comprender el papel de la conformación local del ADN y la cromatina en relación con la unión y la eficiencia reguladora.
4. CRISPRi puede influir en genes que se encuentran muy cerca del gen objetivo. Esto es especialmente importante cuando se dirige a genes que se superponen con otros genes (superposición en sentido directo o inverso) o que están controlados por un promotor bidireccional. ^{[ 26 ]}
5. Se ha informado de toxicidad específica de secuencia en eucariotas, donde algunas secuencias en la región proximal a PAM causan una gran carga de aptitud. ^{[ 27 ]} Este fenómeno, denominado "efecto de semilla mala", aún no se explica, pero puede reducirse optimizando el nivel de expresión de dCas9. ^{[ 28 ]}