Perturba-seq

Perturb-seq (también conocido como CRISP-seq y CROP-seq ) se refiere a un método de alto rendimiento para realizar secuenciación de ARN de células individuales (scRNA-seq) en cribados de perturbación genética agrupados. ^{[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]} Perturb-seq combina inactivaciones genéticas multiplexadas mediadas por CRISPR con secuenciación de ARN de células individuales para evaluar fenotipos de expresión genética completos para cada perturbación. Inferir la función de un gen aplicando perturbaciones genéticas para silenciar o eliminar un gen y estudiar el fenotipo resultante se conoce como genética inversa . Perturb-seq es un enfoque de genética inversa que permite la investigación de fenotipos a nivel del transcriptoma , para dilucidar funciones genéticas en muchas células, de manera masivamente paralela.

El protocolo Perturb-seq utiliza la tecnología CRISPR para inactivar genes específicos y el código de barras de ADN de cada ARN guía para permitir que todas las perturbaciones se agrupen y luego se deconvolucionen, con la asignación de cada fenotipo a un ARN guía específico . ^{[ 1 ] [ 2 ]} Se utilizan plataformas de microfluídica basadas en gotas (u otras técnicas de clasificación y separación celular) para aislar células individuales, y luego se realiza scRNA-seq para generar perfiles de expresión génica para cada célula. Una vez completado el protocolo, se realizan análisis bioinformáticos para asociar cada célula y perturbación específica con un perfil transcriptómico que caracteriza las consecuencias de la inactivación de cada gen.

La cronología del cribado CRISPR de células individuales comenzó el 27 de octubre de 2016 con la publicación del método CROP-seq (secuenciación de gotas CRISPR) como preimpresión en bioRxiv, que posteriormente se publicó en Nature Methods en 2017. ^{[ 4 ]} CROP-seq introdujo una innovación tecnológica clave: un vector lentiviral especializado que permite la lectura directa del ARN guía (ARNg) dentro del transcrito celular. Al evitar la necesidad de códigos de barras expresados ​​separados e indirectamente vinculados, este método simplificó el proceso de clonación y mejoró fundamentalmente la escalabilidad de los cribados agrupados a gran escala.

Poco después de la preimpresión de CROP-seq, en diciembre de 2016, el campo se expandió con la publicación de dos artículos complementarios en Cell que presentaban Perturb-seq, ^{[ 1 ] [ 2 ]} junto con un tercer artículo que describía un enfoque conceptualmente similar denominado CRISP-seq. ^{[ 3 ]} Si bien compartían el avance conceptual central de combinar perturbaciones genéticas agrupadas con secuenciación de ARN de célula única para diseccionar redes reguladoras génicas complejas, estos métodos concurrentes variaban en sus diseños experimentales y analíticos. Por ejemplo, los primeros protocolos de Perturb-seq y CRISP-seq se basaban en reporteros de código de barras expresados ​​vinculados a los ARNg para identificar perturbaciones, y el estudio de CRISP-seq demostró la viabilidad de aplicar esta tecnología para estudiar circuitos inmunitarios in vivo. Estos métodos basados ​​en secuenciación se desarrollaron en paralelo con el cribado óptico agrupado (OPS), que utiliza imágenes de alto rendimiento en lugar de transcriptómica para capturar fenotipos espaciales y morfológicos bajo perturbación genética.

La escalabilidad de este paradigma metodológico culminó en un estudio publicado en junio de 2022 en Cell, que presentó uno de los primeros análisis Perturb-seq a escala genómica. ^{[ 5 ]} Mediante el análisis de millones de células individuales, este trabajo mapeó paisajes genotipo-fenotipo ricos en información a gran escala, descubriendo nuevos reguladores genéticos de la inestabilidad cromosómica y mapeando las respuestas transcripcionales heterogéneas de las células a diferentes formas de estrés mitocondrial. Este hito demostró la transición del cribado CRISPR de células individuales de un marco conceptual novedoso a un motor robusto y de alto rendimiento para el descubrimiento biológico sistemático.

Perturb-seq utiliza tecnologías actuales en biología molecular para integrar un flujo de trabajo de múltiples pasos que combina el cribado de alto rendimiento con resultados fenotípicos complejos. En comparación con métodos alternativos utilizados para la inactivación o eliminación de genes, como el ARN de interferencia (ARNi) , las nucleasas de dedos de zinc o las nucleasas efectoras tipo activador de la transcripción (TALEN), la aplicación de perturbaciones basadas en CRISPR permite mayor especificidad, eficiencia y facilidad de uso. ^{[ 7 ] [ 11 ]} Otra ventaja de este protocolo es que, mientras que la mayoría de los enfoques de cribado solo pueden analizar fenotipos simples, como la viabilidad celular, scRNA-seq permite una lectura fenotípica mucho más rica, con mediciones cuantitativas de la expresión génica en muchas células simultáneamente. Por lo tanto, Perturb-seq puede combinar el alto rendimiento de la genética directa , en términos del número de perturbaciones genéticas, con la rica dimensión fenotípica de la genética inversa . ^{[ 5 ]}

Sin embargo, si bien una gran cantidad de datos completos puede ser beneficiosa, también puede presentar un desafío importante. Se sabe que las lecturas de expresión de ARN de células individuales producen datos "ruidosos", con un número significativo de falsos positivos. ^{[ 12 ]} Tanto el gran tamaño como el ruido asociados con scRNA-seq probablemente requerirán nuevos y potentes métodos computacionales y pipelines bioinformáticos para interpretar mejor los datos resultantes. Otro desafío asociado con este protocolo es la creación de bibliotecas CRISPR a gran escala. La preparación de estas extensas bibliotecas depende de un aumento comparativo en los recursos necesarios para cultivar la enorme cantidad de células que se requieren para lograr una selección exitosa de muchas perturbaciones. ^{[ 7 ]}

Paralelamente a estos métodos de célula única, se han desarrollado otros enfoques para reconstruir vías genéticas mediante la secuenciación de ARN de organismos completos. Estos métodos utilizan una estadística agregada única, denominada coeficiente de epistasis a nivel de transcriptoma, para guiar la reconstrucción de la vía. ^{[ 13 ]} A diferencia del marco estadístico de los métodos descritos anteriormente, este coeficiente puede ser más robusto frente al ruido y se interpreta intuitivamente en términos de epistasis batesoniana. Este enfoque se utilizó para identificar un nuevo estado en el ciclo de vida del nematodo C. elegans . ^{[ 14 ]}

Cuando el fenotipado de la biblioteca combinada se realiza con microcopia, en lugar de secuenciación de ARN, el método se denomina cribado óptico combinado , OPS. ^{[ 15 ]} Este método también se difundió por primera vez en 2016 ^{[ 16 ]} . Permite investigar características celulares espaciales, morfológicas o dinámicas que no se capturan fácilmente con la secuenciación de ARN. Además, OPS utiliza la tecnología CRISPR para inactivar genes específicos y el código de barras de ADN de cada ARN guía para permitir que todas las perturbaciones se agrupen para el fenotipado y posteriormente se deconvolucionen, con la asignación de cada fenotipo a un ARN guía específico . En OPS, los códigos de barras se leen mediante secuenciación in situ.

Perturb-seq u otros protocolos conceptualmente similares pueden utilizarse para abordar un amplio espectro de preguntas biológicas y es probable que las aplicaciones de esta tecnología crezcan con el tiempo. Tres artículos sobre este tema, publicados en el número de diciembre de 2016 de la revista Cell, demostraron la utilidad de este método al aplicarlo a la investigación de varias funciones biológicas distintas. En el artículo, “Perturb-Seq: Diseccionar circuitos moleculares con perfilado de ARN de célula única escalable de cribados genéticos agrupados”, los autores utilizaron Perturb-seq para realizar eliminaciones de factores de transcripción relacionados con la respuesta inmune en cientos de miles de células para investigar las consecuencias celulares de su inactivación. ^{[ 2 ]} También exploraron los efectos de los factores de transcripción en los estados celulares en el contexto del ciclo celular . En el estudio dirigido por la UCSF , “Una plataforma de cribado CRISPR de célula única multiplexada permite la disección sistemática de la respuesta a proteínas desplegadas”, los investigadores suprimieron múltiples genes en cada célula para estudiar la vía de respuesta a proteínas desplegadas (UPR). ^{[ 1 ]} Con una metodología similar, pero usando el término CRISP-seq en lugar de Perturb-seq, el artículo "Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq" realizó un experimento de prueba de concepto usando la técnica para explorar vías reguladoras relacionadas con la inmunidad innata en ratones. ^{[ 3 ]} La letalidad de cada perturbación y los análisis de epistasis en células con múltiples perturbaciones también se investigaron en estos artículos. Perturb-seq se ha usado hasta ahora con muy pocas perturbaciones por experimento, pero teóricamente se puede escalar para abordar todo el genoma. Finalmente, el artículo ^{[ 4 ]} demuestra la reconstrucción bioinformática de la vía de señalización del receptor de células T en células Jurkat basada en datos CROP-seq.

Recientemente, el flujo de trabajo Perturb-seq (CROP-seq) se ha adaptado para permitir cribados CRISPRi (interferencia CRISPR) a escala genómica en células Jurkat con resolución de célula única. ^{[ 17 ]} El primer cribado CRISPRi a escala genómica de su tipo se llevó a cabo para verificar factores involucrados en las vías de señalización del TCR. Más concretamente, se utilizó una biblioteca de ARN guía dirigida a 18.595 genes humanos para la inactivación génica basada en CRISPR en células Jurkat que expresan la endonucleasa de fusión dCas9- KRAB . En total, se procesó un millón de células Jurkat para la secuenciación de ARN de célula única, lo que permitió obtener lecturas transcriptómicas de una lista final de 374 genes marcadores involucrados en la señalización del TCR. El análisis bioinformático confirmó más de 70 activadores y represores conocidos de las cascadas de señalización del TCR, lo que demuestra el potencial de los cribados Perturb-seq (CROP-seq) para apoyar la investigación traslacional.

Si bien estas publicaciones utilizaron estos protocolos para responder preguntas biológicas complejas, esta tecnología también puede emplearse como ensayo de validación para garantizar la especificidad de cualquier silenciamiento o eliminación génica basada en CRISPR. Los niveles de expresión de los genes diana, así como de otros, pueden medirse con resolución de célula individual en paralelo para determinar si la perturbación fue exitosa y evaluar los efectos fuera de objetivo del experimento. Además, estos protocolos permiten realizar cribados de perturbación en tejidos heterogéneos, obteniendo respuestas de expresión génica específicas para cada tipo celular.