Cas13

Cas13 es una familia de endonucleasas asociadas a CRISPR ortólogas que se dirigen al ARN (a diferencia de Cas9 y Cas12 , que se dirigen al ADN ). Cas13 utiliza una única endonucleasa guiada por ARN para unirse y escindir secuencias específicas de ARN monocatenario . Emplea dos funciones de ribonucleasa distintas : una procesa su propio ARN CRISPR (crRNA) y otra degrada el ARN diana. ^{[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]} La especificidad del sistema permite la corrección de mutaciones a nivel de transcripción .

Cas13 permanece unido al objetivo y luego escinde otras moléculas de ssRNA no discriminatoriamente. ^{[ 4 ]} Esta propiedad de escisión colateral se explota en el desarrollo de varias tecnologías de diagnóstico. ^{[ 5 ] [ 6 ] [ 7 ]} Se ha utilizado para reparar eficientemente el ARNm KRAS -G12D en modelos de cáncer de páncreas minimizando los efectos en las células sanas; ^{[ 1 ]} adaptado en herramientas como la plataforma REPAIR, que edita bases de ARN para tratar trastornos genéticos, incluido el síndrome de Usher , en modelos animales; y utilizado en plataformas de diagnóstico como SHERLOCK para detectar patógenos, ADN tumoral y variantes virales con alta sensibilidad. ^{[ 3 ]} Su focalización independiente de PAM y los efectos fuera del objetivo reducidos lo hacen adecuado para imágenes de ARN, ingeniería del genoma de fagos y regulación génica transitoria. ^{[ 2 ]}

En 2016, investigadores del grupo de Feng Zhang en el MIT y el Broad Institute caracterizaron la nucleasa.Cas13a (anteriormenteC2c2 ) de la bacteria Leptotrichia shahii . ^{[ 8 ]} Su propiedad de escisión colateral es fundamental para varias tecnologías de diagnóstico. ^{[ 9 ] [ 10 ] [ 11 ]}

En 2018, un equipo liderado por Silvana Konermann y Patrick Hsu en el Instituto Salk identificó Cas13d, una subclase compacta de efectores CRISPR dirigidos al ARN. Una variante modificada de Cas13d de Ruminococcus flavefaciens , denominada CasRx, demostró alta eficiencia y especificidad en células humanas en comparación con la interferencia de ARN . CasRx puede empaquetarse en vectores de virus adenoasociados (AAV) para la ingeniería del transcriptoma y la terapia génica . ^{[ 12 ]}

En 2021, los investigadores caracterizaron variantes de la proteína Cas13 en miniatura, Cas13X y Cas13Y. Estudios que utilizaron la secuencia del gen N del SARS-CoV-2 como objetivo demostraron que mCas13, cuando se combina con RT-LAMP , detectó el SARS-CoV-2 en muestras sintéticas y clínicas con alta sensibilidad y especificidad , comparable a la RT-qPCR . ^{[ 13 ]}

Cas13 se ha adaptado para funcionar como un editor de ARN capaz de corregir mutaciones sin modificar el ADN. El sistema REPAIR utiliza una Cas13 catalíticamente inactiva (dCas13) que se une al ARN diana sin cortarlo. Esta dCas13 está fusionada al dominio catalítico de ADAR2 , una enzima que convierte la adenosina (A) en inosina (I), la cual es interpretada por la maquinaria celular como guanosina (G). Este complejo puede dirigirse a ubicaciones específicas del ARNm para corregir mutaciones causantes de enfermedades . ^{[ 14 ]}

Combinado con una variante de ADAR2 de alta fidelidad, el sistema REPAIR ha demostrado la capacidad de editar dianas con mínimos efectos fuera de diana . En modelos murinos del síndrome de Usher , el sistema dCas13–ADAR, administrado mediante vectores virales , restauró los niveles de proteína usherina , corrigió transcritos defectuosos y mejoró la visión. Estos resultados indican que la edición de ARN mediada por Cas13 podría ofrecer un enfoque viable para el tratamiento de trastornos genéticos. ^{[ 15 ]}

Las mejoras posteriores han dado lugar al desarrollo de la Cas13b "inactiva", que conserva la capacidad de unión pero carece de actividad de escisión. Combinado con un ARN guía que incluye un desajuste específico de A a C en el sitio diana, este sistema dirige a la enzima ADAR2 para editar una sola base. Las pruebas iniciales en células humanas mostraron una edición fiable dentro de una ventana de 30 nucleótidos con una precisión significativa. ^{[ 16 ]}

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