Fragmentación (biología celular)

La fragmentación describe el proceso de división en varios fragmentos. En biología celular , la fragmentación es útil para la célula tanto en la clonación de ADN como en la apoptosis. La clonación de ADN es importante en la reproducción asexual o la creación de moléculas de ADN idénticas, y puede realizarse de forma espontánea por la célula o de forma intencionada por investigadores de laboratorio. La apoptosis es la destrucción programada de las células y las moléculas de ADN que contienen, y es un proceso altamente regulado. Estas dos formas en que se utiliza la fragmentación en los procesos celulares describen funciones celulares normales y procedimientos de laboratorio comunes realizados con células. Sin embargo, los problemas dentro de una célula a veces pueden causar fragmentación, lo que resulta en irregularidades como la fragmentación de los glóbulos rojos y la fragmentación del ADN de los espermatozoides.

La clonación de ADN puede realizarse espontáneamente por la célula con fines reproductivos. Esta es una forma de reproducción asexual en la que un organismo se divide en fragmentos y luego cada uno de estos fragmentos se desarrolla en individuos maduros y completamente desarrollados que son clones del organismo original (véase fragmentación reproductiva ). La clonación de ADN también puede realizarse intencionalmente por investigadores de laboratorio. En este caso, la fragmentación de ADN es una técnica de genética molecular que permite a los investigadores utilizar la tecnología de ADN recombinante para preparar grandes cantidades de moléculas de ADN idénticas. Para que la clonación de ADN se complete, es necesario obtener regiones pequeñas y discretas del ADN de un organismo que constituyan genes específicos . Solo las moléculas de ADN relativamente pequeñas pueden clonarse en cualquier vector disponible . Por lo tanto, las largas moléculas de ADN que componen el genoma de un organismo deben dividirse en fragmentos que puedan insertarse en el ADN del vector. ^{[ 1 ]} Dos enzimas facilitan la producción de dichas moléculas de ADN recombinante:

1. Enzimas de restricción

Las enzimas de restricción son endonucleasas producidas por bacterias que generalmente reconocen secuencias cortas de pares de bases (llamadas sitios de restricción ) y luego cortan ambas hebras de ADN en ese sitio. ^{[ 2 ]} Un sitio de restricción suele ser una secuencia palindrómica , lo que significa que la secuencia del sitio de restricción es la misma en cada hebra de ADN cuando se lee en la dirección 5' a 3'.

Para cada enzima de restricción, las bacterias también producen una enzima modificadora que protege el ADN de la bacteria huésped de la escisión. Esto se logra modificando el ADN del huésped en o cerca de cada posible sitio de escisión. La enzima modificadora añade un grupo metilo a una o dos bases, y la presencia de este grupo metilo impide que la endonucleasa de restricción corte el ADN. ^{[ 3 ]}

Muchas enzimas de restricción realizan cortes escalonados en las dos hebras de ADN en su sitio de reconocimiento, lo que genera fragmentos con una "cola" de una sola hebra que sobresale en ambos extremos, denominada extremo cohesivo. Las enzimas de restricción también pueden realizar cortes rectos en las dos hebras de ADN en su sitio de reconocimiento, lo que genera extremos romos. ^{[ 4 ]}

2. ADN ligasa

Durante la replicación normal del ADN , la ADN ligasa cataliza la unión extremo con extremo (ligación) de fragmentos cortos de ADN, denominados fragmentos de Okazaki . Para la clonación de ADN, se utiliza ADN ligasa purificada para unir covalentemente los extremos de un fragmento de restricción y un ADN vector que tienen extremos complementarios. Estos se ligan covalentemente mediante los enlaces fosfodiéster 3' a 5' estándar del ADN. ^{[ 5 ]}

La ADN ligasa puede ligar extremos cohesivos y romos complementarios , pero la ligación de extremos romos es ineficiente y requiere una mayor concentración tanto de ADN como de ADN ligasa que la ligación de extremos cohesivos. ^{[ 6 ]} Por esta razón, la mayoría de las enzimas de restricción utilizadas en la clonación de ADN realizan cortes escalonados en las hebras de ADN para crear extremos cohesivos.

La clave para clonar un fragmento de ADN reside en vincularlo a una molécula de ADN vector que pueda replicarse dentro de una célula huésped. Una vez introducida una única molécula de ADN recombinante (compuesta por un vector más un fragmento de ADN insertado) en una célula huésped, el ADN insertado puede replicarse junto con el vector, generando un gran número de moléculas de ADN idénticas. ^{[ 7 ]} El esquema básico para esto se puede resumir de la siguiente manera:

Vector + Fragmento de ADN

↓

ADN recombinante

↓

Replicación del ADN recombinante dentro de la célula huésped

↓

Aislamiento, secuenciación y manipulación de fragmentos de ADN purificados.

Existen numerosas variaciones experimentales de este esquema, pero estos pasos son esenciales para la clonación de ADN en un laboratorio. ^{[ 8 ]}

La apoptosis se refiere a la muerte celular por una forma específica de muerte celular programada , caracterizada por una secuencia bien definida de cambios morfológicos. ^{[ 10 ]} La contracción celular y nuclear, la condensación y fragmentación de la cromatina, la formación de cuerpos apoptóticos y la fagocitosis por células vecinas caracterizan los principales cambios morfológicos en el proceso de apoptosis. ^{[ 11 ]} Los extensos cambios morfológicos y bioquímicos durante la apoptosis aseguran que las células moribundas tengan un impacto mínimo en las células y/o tejidos vecinos.

Los genes implicados en el control de la muerte celular codifican proteínas con tres funciones distintas: ^{[ 12 ]}

• Las proteínas "asesinas" son necesarias para que una célula inicie el proceso apoptótico.
• Las proteínas de "destrucción" realizan funciones como la digestión del ADN en una célula moribunda.
• Las proteínas de "fagocitosis" son necesarias para que otra célula fagocite la célula moribunda.

La escisión del ADN cromosómico en fragmentos más pequeños es una parte integral y un sello distintivo bioquímico de la apoptosis. La apoptosis implica la activación de endonucleasas con la posterior escisión del ADN de la cromatina en fragmentos de 180 pares de bases o múltiplos de 180 pares de bases (por ejemplo, 360, 540). Este patrón de fragmentación puede utilizarse para detectar la apoptosis en pruebas como un ensayo de escalera de ADN con electroforesis en gel , un ensayo TUNEL o un ensayo de Nicoletti . ^{[ 13 ]} La fragmentación del ADN apoptótico depende de una enzima llamada DNasa activada por caspasa (CAD) . ^{[ 14 ]} La CAD suele ser inhibida por otra proteína en la célula, llamada inhibidor de la DNasa activada por caspasa (ICAD) . ^{[ 15 ]} Para que comience la apoptosis, una enzima llamada caspasa 3 escinde la ICAD para que la CAD se active. La enzima CAD luego corta el ADN entre los nucleosomas , que se encuentran en la cromatina a intervalos de 180 pares de bases. Los sitios entre los nucleosomas son las únicas partes del ADN que están expuestas y accesibles a la enzima CAD. ^{[ 16 ]}

La fragmentación del ADN puede ocurrir bajo ciertas condiciones en algunos tipos de células. Esto puede causar problemas a la célula o provocar que reciba una señal para entrar en apoptosis. A continuación, se muestran algunos ejemplos de fragmentación irregular que puede ocurrir en las células.

1. Fragmentación de glóbulos rojos

Un glóbulo rojo fragmentado se conoce como esquistocito y generalmente es el resultado de una lesión mecánica intracelular en el glóbulo rojo. ^{[ 17 ]} Se puede observar una amplia variedad de esquistocitos. Los esquistocitos suelen verse en cantidades relativamente bajas y se asocian con afecciones en las que el revestimiento endotelial normalmente liso, o endotelio , está rugoso o irregular, y/o la luz vascular está atravesada por hebras de fibrina . ^{[ 18 ]} Los esquistocitos se observan comúnmente en pacientes que tienen anemia hemolítica . También son una característica de la anemia por deficiencia de hierro avanzada , pero en este caso la fragmentación observada es más probablemente el resultado de la fragilidad de las células producidas en estas condiciones.

2. Fragmentación del ADN de los espermatozoides

En un hombre promedio, menos del 4% de sus espermatozoides contienen ADN fragmentado. Sin embargo, comportamientos como fumar pueden aumentar significativamente la fragmentación del ADN en los espermatozoides. Existe una correlación negativa entre el porcentaje de fragmentación del ADN y la motilidad, morfología y concentración de los espermatozoides. Asimismo, existe una asociación negativa entre el porcentaje de espermatozoides con ADN fragmentado y la tasa de fertilización y la tasa de división embrionaria. ^{[ 19 ]}