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ADN libre circulante

El ADN libre circulante (ADNcf) (también conocido como ADN libre de células) son fragmentos de ADN degradados que se liberan a los fluidos corporales, como el plasma sanguíneo, ...

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El ADN libre circulante (ADNcf) (también conocido como ADN libre de células) son fragmentos de ADN degradados que se liberan a los fluidos corporales, como el plasma sanguíneo, la orina , el líquido cefalorraquídeo , etc. Los tamaños típicos de los fragmentos de ADNcf reflejan partículas de cromatosomas (~165 pb), así como múltiplos de nucleosomas , que protegen el ADN de la digestión por nucleasas apoptóticas. [ 1 ] El término ADNcf puede usarse para describir varias formas de ADN que circulan libremente en los fluidos corporales, incluyendo el ADN tumoral circulante (ADNtc) , el ADN mitocondrial libre de células (ADNmtcf), el ADN fetal libre de células (ADNffc) y el ADN libre de células derivado del donante (ADNcf-dd). [ 2 ]

Se observan niveles elevados de cfDNA en el cáncer , especialmente en la enfermedad avanzada. [ 3 ] Existe evidencia de que el cfDNA se vuelve cada vez más frecuente en la circulación con el inicio de la edad. [ 4 ] Se ha demostrado que el cfDNA es un biomarcador útil para una multitud de dolencias además del cáncer y la medicina fetal. Esto incluye, pero no se limita a, traumatismos, sepsis , inflamación aséptica , infarto de miocardio , accidente cerebrovascular, trasplante , diabetes y enfermedad de células falciformes . [ 5 ] El cfDNA es principalmente una molécula extracelular de ADN de doble cadena, que consta de pequeños fragmentos (50 a 200 pb ) [ 6 ] [ 7 ] y fragmentos más grandes (21 kb) [ 8 ] y se ha reconocido como un marcador preciso para el diagnóstico de cáncer de próstata y cáncer de mama . [ 9 ]

Estudios recientes han sentado las bases para inferir la expresión génica a partir de ADN libre de células, y EPIC-seq se ha consolidado como un avance notable. [ 10 ] Este método ha elevado sustancialmente el nivel de la inferencia no invasiva de los niveles de expresión de genes individuales, aumentando así la aplicabilidad del ensayo en la caracterización de enfermedades, la clasificación histológica y el seguimiento de la eficacia del tratamiento. [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ]

Otras publicaciones confirman el origen del ADN libre circulante (ADNlc) a partir de carcinomas y su presencia en pacientes con cáncer avanzado. El ADN libre circulante (ADNlc) está presente en el plasma circulante y en otros fluidos corporales . [ 13 ]

La liberación de ADN libre circulante (cfDNA) al torrente sanguíneo se produce por diversas razones, como la apoptosis , la necrosis y la NETosis . Su rápida acumulación en sangre durante el desarrollo tumoral se debe a una liberación excesiva de ADN por parte de células apoptóticas y necróticas . Se ha analizado la secreción activa dentro de los exosomas , pero aún se desconoce si constituye una fuente relevante o relativamente menor de cfDNA. [ 14 ]

El cfDNA circula predominantemente como nucleosomas , que son complejos nucleares de histonas y ADN. [ 15 ] El cfDNA también puede observarse en rangos de tamaño más cortos (por ejemplo, 50 pb) y asociado con elementos reguladores. [ 16 ] Con frecuencia se encuentran elevados de forma inespecífica en el cáncer , pero pueden ser más específicos para el seguimiento de la terapia citotóxica contra el cáncer , principalmente para la estimación temprana de la eficacia de la terapia . [ 17 ]

Historia

Circulating nucleic acids were first discovered by Mandel and Metais in 1948.[18] It was later discovered that the level of cfDNA is significantly increased in the plasma of diseased patients. This discovery was first made in lupus patients[19] and later it was determined that the levels of cfDNA are elevated in over half of cancer patients.[20] Molecular analysis of cfDNA resulted in an important discovery that blood plasma DNA from cancer patients contains tumor-associated mutations and it can be used for cancer diagnostics and follow up.[21][22] The ability to extract circulating tumor DNA (ctDNA) from the human plasma has led to huge advancements in noninvasive cancer detection.[23] Most notably, it has led to what is now known as liquid biopsy. In short, liquid biopsy is using biomarkers and cancer cells in the blood as a means of diagnosing cancer type and stage.[24] This type of biopsy is noninvasive and allows for the routine clinical screening that is important in determining cancer relapse after initial treatment.[25]

Different origins of cfDNA

El origen intracelular del cfDNA, por ejemplo, ya sea del núcleo o de las mitocondrias , también puede influir en el potencial inflamatorio del cfDNA. El mtDNA es un potente desencadenante inflamatorio . [ 26 ] El mtDNA, debido a su origen procariótico , posee muchas características similares al ADN bacteriano , incluida la presencia de un contenido relativamente alto de motivos CpG no metilados , que rara vez se observan en el ADN nuclear. [ 27 ] Los motivos CpG no metilados son de particular importancia ya que TLR9 , el único receptor endolisosomal de detección de ADN, tiene una especificidad única para el ADN CpG no metilado . Se ha demostrado que el mtDNA activa los neutrófilos a través de la interacción con TLR9 [ 28 ] a menos que esté acoplado a proteínas transportadoras , el mtDNA, pero no el ADN nuclear, puede ser reconocido como un patrón molecular asociado al peligro que induce proinflamación a través de TLR9. [ 29 ] Collins et al. Se ha informado que la inyección intraarticular de ADNmt induce artritis in vivo, lo que sugiere un papel directo de la extrusión de ADNmt en la patogénesis de la artritis reumatoide y las enfermedades reumáticas autoinmunes. [ 29 ] [ 30 ]

El ADN mitocondrial ( ADNmt), a diferencia del ADN nuclear , se caracteriza por niveles basales elevados de 8-OHdG , un marcador de daño oxidativo. El alto contenido de daño oxidativo en el ADNmt se atribuye a la proximidad del ADNmt a las especies reactivas de oxígeno (ROS) y a mecanismos de reparación del ADN relativamente ineficientes que pueden conducir a la acumulación de lesiones en el ADN. [ 30 ] [ 31 ]

Han demostrado que la explosión oxidativa durante la NETosis puede oxidar el ADNmt y el ADNmt oxidado liberado por sí mismo, o en complejo con TFAM , puede generar una inducción prominente de IFN de tipo I. [ 26 ] El ADNmt oxidado generado durante la muerte celular programada no se limita a activar TLR9, sino que también se ha demostrado que involucra el inflamasoma NLRP3 , lo que lleva a la producción de citocinas proinflamatorias , IL-1β e IL-18 . [ 30 ] [ 32 ] El ADNmt también puede ser reconocido por la sintasa de GMP -AMP cíclico (cGAS), un sensor de ADN bicatenario citosólico para iniciar una vía dependiente de STING-IRF3 que a su vez orquesta la producción de IFN de tipo I. [ 30 ] [ 33 ]

Métodos

Recolección y purificación

La purificación de cfDNA es susceptible a la contaminación por ADN genómico debido a la ruptura de células sanguíneas durante el proceso de purificación. [ 34 ] Por ello, los diferentes métodos de purificación pueden generar rendimientos de extracción de cfDNA significativamente diferentes. [ 35 ] [ 36 ] Actualmente, los métodos de purificación típicos implican la extracción de sangre mediante venopunción , la centrifugación para sedimentar las células y la extracción de cfDNA del plasma. El método específico para la extracción de cfDNA del plasma depende del protocolo deseado. [ 37 ]

Análisis del ADN libre circulante

reacción en cadena de la polimerasa

En general, la detección de secuencias de ADN específicas en el ADN libre circulante (ADNlc) se puede realizar de dos maneras: detección específica de secuencia (mediante reacción en cadena de la polimerasa , comúnmente llamada PCR) y análisis genómico general de todo el ADNlc presente en la sangre ( secuenciación de ADN ). [ 38 ] La presencia de ADNlc que contiene ADN de células tumorales se caracterizó originalmente mediante la amplificación por PCR de genes mutados a partir de ADNlc extraído. [ 21 ] El análisis de ADNlc basado en PCR generalmente se basa en la naturaleza analítica de la PCR cuantitativa (qPCR) y la PCR digital . Ambas técnicas pueden ser sensibles y rentables para detectar un número limitado de mutaciones puntuales. Por esta razón, el método de detección basado en PCR sigue siendo una herramienta muy importante en la detección de ADNlc. Este método tiene la limitación de no poder detectar variantes estructurales más grandes presentes en el ADN tumoral circulante (ADNtc), y por esta razón también se utiliza la secuenciación masiva paralela de próxima generación para determinar el contenido de ADNtc en el ADNlc.

Secuenciación masivamente paralela

La secuenciación masivamente paralela (MPS) ha permitido la secuenciación profunda del ADN libre circulante (cfDNA). Esta secuenciación profunda es necesaria para detectar el ADN tumoral circulante mutante (ctDNA) presente en bajas concentraciones en el plasma. Para el análisis dirigido del cfDNA mutante se suelen utilizar dos técnicas principales de secuenciación: la secuenciación de amplicones de PCR [ 39 ] y la secuenciación de captura híbrida [ 40 ] . Otras formas de alteraciones genéticas pueden analizarse mediante ctDNA (por ejemplo, alteraciones somáticas del número de copias o reordenamientos genéticos). En este caso, se utilizan principalmente métodos basados ​​en la secuenciación no dirigida, como la secuenciación del genoma completo (WGS) o la WGS de baja cobertura. Numerosas características epigenéticas del tejido de origen pueden extraerse de la WGS del cfDNA, como el espaciamiento de los nucleosomas [ 41 ] y el estado de metilación del ADN [ 42 ] [ 43 ] .

ADN libre circulante y enfermedad

Cáncer

La mayor parte de la investigación sobre el ADN libre circulante (cfDNA) se centra en el ADN originado por el cáncer ( ctDNA ). En resumen, el ADN de las células cancerosas se libera por muerte celular, secreción u otros mecanismos aún desconocidos. [ 44 ] La fracción de cfDNA liberada por las células tumorales en circulación está influenciada por el tamaño del tumor, así como por su estadio y tipo. Los cánceres en estadio temprano y los tumores cerebrales se encuentran entre los más difíciles de detectar mediante biopsia líquida. [ 45 ] [ 46 ] [ 47 ]

Trauma

Se ha detectado un aumento del cfDNA en casos de traumatismo contuso agudo [ 48 ] y en víctimas de quemaduras [ 49 ] . En ambos casos, la concentración de cfDNA en el plasma se correlacionó con la gravedad de la lesión, así como con el pronóstico del paciente.

Septicemia

Se ha demostrado que un aumento del cfDNA en el plasma de pacientes de la UCI es un indicador del inicio de la sepsis . [ 50 ] [ 51 ] Debido a la gravedad de la sepsis en pacientes de la UCI, es probable que se requieran más pruebas para determinar el alcance de la eficacia del cfDNA como biomarcador del riesgo de sepsis. [ 5 ]

Infarto de miocardio

Se ha demostrado que los pacientes que presentan signos de infarto de miocardio tienen niveles elevados de cfDNA. [ 52 ] Esta elevación se correlaciona con el pronóstico del paciente en términos de problemas cardíacos adicionales e incluso mortalidad en un plazo de dos años. [ 53 ]

rechazo del injerto trasplantado

Se ha demostrado la presencia de cfDNA extraño en el plasma de pacientes trasplantados de órganos sólidos. Este cfDNA se deriva del órgano trasplantado y se denomina dd-cfDNA (ADN libre de células derivado del donante). Los valores de dd-cfDNA aumentan inicialmente después de un procedimiento de trasplante (>5%), dependiendo en gran medida del órgano trasplantado, y suelen disminuir (<0,5%) en una semana para la mayoría de los órganos. [ 54 ] Si el cuerpo del receptor rechaza el órgano trasplantado, la concentración de ddcfDNA en la sangre (plasma) aumentará a un nivel más de 5 veces superior al de aquellos sin complicaciones. Este aumento de ddcfDNA puede detectarse antes de cualquier otro signo clínico o bioquímico de complicación. [ 54 ] Además del dd-cfDNA en plasma, algunas investigaciones también se han centrado en la excreción de ddcfDNA a través de la orina. Esto es de especial interés en el trasplante de aloinjertos renales. Cuando se mide el dd-cfDNA mediante secuenciación de próxima generación dirigida , se utilizan ensayos con un panel de SNP de todo el genoma específico de la población. [ 55 ] La unión de códigos de barras a los adaptadores ligados antes de la NGS durante la preparación de la biblioteca permite la cuantificación absoluta del ddcfDNA sin necesidad de genotipado previo del donante. [ 56 ] Se ha demostrado que esto proporciona beneficios clínicos adicionales si se considera el número absoluto de copias de cfDNA combinado con la fracción de ddcfDNA sobre cfDNA del receptor para determinar si el aloinjerto está siendo rechazado o no. [ 55 ]

Direcciones futuras

El cfDNA permite un método de muestreo rápido, sencillo, no invasivo y repetible. La combinación de estas características biológicas y la viabilidad técnica del muestreo posicionan al cfDNA como un biomarcador potencial de enorme utilidad, por ejemplo, para enfermedades reumáticas autoinmunes y tumores. También ofrece un biomarcador potencial con ventajas propias sobre la biopsia de tejido invasiva como medida cuantitativa para la detección del rechazo de trasplantes, así como para la optimización de la inmunosupresión. Sin embargo, este método carece de uniformidad en cuanto al tipo de muestra (plasma/suero/líquido sinovial/orina), los métodos de recolección/procesamiento de la muestra, el ADN libre o unido a la superficie celular, la extracción y cuantificación del cfDNA, y también en la presentación e interpretación de los resultados cuantitativos del cfDNA. [ 30 ]

El cfDNA se cuantifica mediante métodos de fluorescencia, como la tinción con PicoGreen y la espectrometría ultravioleta; la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa ( PCR ; SYBR Green o TaqMan) de elementos repetitivos o genes constitutivos , o los métodos de secuenciación profunda , son más sensibles. Los nucleosomas circulantes, la unidad repetitiva primaria de la organización del ADN en la cromatina , se cuantifican mediante ensayos inmunoenzimáticos ( ELISA ). [ 57 ]

Bases de datos

  • NucPosDB: una base de datos sobre el posicionamiento de nucleosomas in vivo y la nucleosómica del ADN libre de células.

Referencias

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