Biblioteca (biología)

Una biblioteca de ADNc representa una muestra de ARNm purificado de una fuente específica (ya sea un conjunto de células, un tejido en particular o un organismo completo), que ha sido convertida de nuevo en una plantilla de ADN mediante la enzima transcriptasa inversa . Por lo tanto, representa los genes que se transcribían activamente en esa fuente específica bajo las condiciones fisiológicas, de desarrollo o ambientales existentes cuando se purificó el ARNm. Las bibliotecas de ADNc pueden generarse mediante técnicas que promueven clones de longitud completa o en condiciones que generan fragmentos más cortos utilizados para la identificación de secuencias de etiquetas expresadas (SSE ).

Las bibliotecas de ADNc son útiles en la genética inversa, pero solo representan una porción muy pequeña (menos del 1%) del genoma total de un organismo determinado.

Las aplicaciones de las bibliotecas de ADNc incluyen:

• Descubrimiento de nuevos genes
• Clonación de moléculas de ADNc de longitud completa para el estudio in vitro de la función génica.
• Estudio del repertorio de ARNm expresados ​​en diferentes células o tejidos.
• Estudio del empalme alternativo en diferentes células o tejidos.

Una biblioteca genómica es un conjunto de clones que, en conjunto, representan el genoma completo de un organismo determinado. El número de clones que la componen depende de (1) el tamaño del genoma en cuestión y (2) el tamaño del fragmento de ADN que admite el sistema de clonación . En la mayoría de los casos prácticos, la procedencia del ADN genómico no es relevante, ya que cada célula del organismo contiene un ADN prácticamente idéntico (con algunas excepciones).

Las aplicaciones de las bibliotecas genómicas incluyen:

• Determinación de la secuencia genómica completa de un organismo determinado (véase proyecto del genoma ).
• Sirve como fuente de secuencia genómica para la generación de animales transgénicos mediante ingeniería genética.
• Estudio de la función de las secuencias reguladoras in vitro
• Estudio de mutaciones genéticas en tejidos cancerosos

A diferencia de los tipos de bibliotecas descritos anteriormente, existen diversos métodos artificiales para crear bibliotecas de genes variantes. ^{[ 1 ]} La variación a lo largo del gen puede introducirse aleatoriamente mediante PCR propensa a errores , ^{[ 2 ]} recombinación de ADN para combinar partes de genes similares, ^{[ 3 ]} o métodos basados ​​en transposones para introducir inserciones/deleciones . ^{[ 4 ]} Alternativamente, las mutaciones pueden dirigirse a codones específicos durante la síntesis de novo o la mutagénesis de saturación para construir uno o más mutantes puntuales de un gen de forma controlada. ^{[ 5 ]} Esto da como resultado una mezcla de moléculas de ADN de doble cadena que representan variantes del gen original.

Las proteínas expresadas a partir de estas bibliotecas pueden luego ser analizadas para identificar variantes que presenten propiedades favorables (por ejemplo, estabilidad, afinidad de unión o actividad enzimática). Esto puede repetirse en ciclos de creación de variantes genéticas y análisis de los productos de expresión en un proceso de evolución dirigida . ^{[ 1 ]}

Si se crea una biblioteca de ARNm (es decir, con clones de ADNc), existen varios protocolos posibles para aislar el ARNm de longitud completa. Para extraer ADN para bibliotecas de ADN genómico (también conocido como ADNg), puede resultar útil una minipreparación de ADN.

Las bibliotecas de ADNc requieren cuidado para asegurar que se capturen clones completos de ARNm como ADNc (que posteriormente se insertarán en vectores). Por este motivo, se han diseñado varios protocolos para optimizar la síntesis de la primera y la segunda cadena de ADNc, y también para facilitar la clonación direccional en el vector.

Los fragmentos de ADN genómico se generan a partir del ADN genómico extraído mediante el uso de enzimas de restricción de corte frecuente no específicas.

Las secuencias de nucleótidos de interés se conservan como inserciones en un plásmido o en el genoma de un bacteriófago que se ha utilizado para infectar células bacterianas.

Los vectores se propagan con mayor frecuencia en células bacterianas, pero si se utiliza un YAC (cromosoma artificial de levadura), también se pueden usar células de levadura. Los vectores también se pueden propagar en virus, pero esto puede ser laborioso y tedioso. Sin embargo, la alta eficiencia de transfección que se logra con los virus (a menudo fagos) los hace útiles para empaquetar el vector (con el inserto ligado) y luego introducirlo en la célula bacteriana (o de levadura).

Además, para bibliotecas de ADNc, se ha desarrollado un sistema que utiliza el fago Lambda Zap II, ExAssist y dos especies de E. coli. También se puede utilizar un sistema Cre-Lox con sitios loxP y la expresión in vivo de la enzima recombinasa. Estos son ejemplos de sistemas de escisión in vivo. La escisión in vitro implica la subclonación, a menudo mediante enzimas de restricción y estrategias de clonación tradicionales. La escisión in vitro puede ser más laboriosa y requerir más trabajo manual que los sistemas de escisión in vivo. En ambos casos, los sistemas permiten el traslado del vector del fago a una célula viva, donde el vector puede replicarse y propagarse hasta que la biblioteca esté lista para su uso.