Toxina A de Clostridioides difficile

La toxina A de Clostridioides difficile ( TcdA ) es una toxina producida por la bacteria Clostridioides difficile , anteriormente conocida como Clostridium difficile . ^{[ 1 ]} Es similar a la toxina B de Clostridioides difficile . Las toxinas son los principales factores de virulencia producidos por la bacteria grampositiva , anaerobia, ^{[ 2 ]} Clostridioides difficile . Las toxinas funcionan dañando la mucosa intestinal y causando los síntomas de la infección por C. difficile , incluida la colitis pseudomembranosa .

TcdA es una de las toxinas bacterianas más grandes conocidas. Con una masa molecular de 308  kDa, se suele describir como una potente enterotoxina , ^{[ 3 ]} pero también tiene cierta actividad como citotoxina . ^{[ 4 ]} La toxina actúa modificando las proteínas GTPasa de la célula huésped mediante glucosilación, lo que provoca cambios en las actividades celulares. Entre los factores de riesgo para la infección por C. difficile se incluye el tratamiento con antibióticos, que puede alterar la microbiota intestinal normal y provocar la colonización por la bacteria C. difficile . ^{[ 5 ]}

El gen contiene un marco de lectura abierto (ORF) de 8133 nucleótidos , que codifica para 2710 aminoácidos . TcdA y TcdB comparten un 63 % de homología en sus secuencias de aminoácidos. ^{[ 6 ]} Estos genes se expresan durante la fase logarítmica tardía y la fase estacionaria en respuesta a factores ambientales. El estrés ambiental, como los antibióticos y la represión catabólica, puede influir en la expresión de la toxina. ^{[ 7 ]}

Los genes tcdA y tcdB se encuentran en el cromosoma de Clostridioides difficile en un locus de patogenicidad de 19,6 kb (PaLoc) que se encuentra solo en cepas toxigénicas de C. difficile . Las cepas no toxigénicas contienen un fragmento de 127 pares de bases que reemplaza al PaLoc. ^{[ 8 ]} Este locus también contiene otros tres genes accesorios: tcdC , tcdR y tcdE . ^{[ 9 ]} La expresión de TcdC es alta durante la fase exponencial temprana y disminuye a medida que el crecimiento avanza hacia la fase estacionaria , lo que concuerda con los aumentos en la expresión de tcdA y tcdB . En consecuencia, los patrones de expresión han indicado que tcdC es un posible regulador negativo de la producción de toxinas. tcdR puede servir como regulador positivo de la producción de toxinas. ^{[ 7 ]} Se ha especulado que tcdE facilita la liberación de TcdA y TcdB a través de la actividad lítica en la membrana celular bacteriana. Debido a su homología con otras proteínas de función similar, así como a la ubicación del gen entre tcdA y tcdB , se predice que tcdE funciona como la proteína lítica que facilita la liberación ya que TcdA y TcdB carecen de un péptido señal para la secreción . ^{[ 8 ]}

La proteína contiene tres dominios. El dominio N-terminal amino contiene el sitio activo , responsable de la actividad glucosilante de la toxina. Tanto TcdA como TcdB utilizan esta región N-terminal altamente conservada (74% de homología entre ambas toxinas) para alterar sustratos idénticos . ^{[ 7 ]}

El dominio C-terminal carboxilo contiene unidades repetitivas responsables de la unión al receptor en la superficie de las células diana. Estas cortas unidades repetitivas homólogas se denominan oligopéptidos repetitivos combinados (CROPs). ^{[ 7 ] [ 10 ]} Un estudio reciente demuestra que los CROPs determinan la potencia de TcdA mediante interacciones con estructuras de la superficie celular. ^{[ 11 ]} Estas regiones CROP abarcan de 21 a 50 residuos y desempeñan un papel en la unión al receptor. ^{[ 7 ]} Esta región repetitiva C-terminal se denomina región inmunodominante, ya que la unión del ligando puede bloquearse mediante anticuerpos monoclonales específicos para esta región. ^{[ 12 ] [ 13 ]} Esta región contiene la porción más hidrofílica de la molécula. ^{[ 10 ]}

Se cree que un dominio hidrofóbico ubicado centralmente que contiene un grupo de 172 aminoácidos hidrofóbicos altamente conservados es importante para la translocación de la porción enzimática de la proteína. ^{[ 5 ] [ 6 ]}

La TcdA debe ser internalizada en la célula huésped mediante endocitosis para acceder al citosol . La unión al receptor es el primer paso necesario para la entrada en la célula mediante endocitosis en un endosoma ácido . ^{[ 6 ]} El pH bajo en el endosoma induce cambios estructurales como la exposición de los dominios hidrofóbicos que son cruciales para la función de la TcdA. ^{[ 7 ] [ 14 ]}

El dominio N-terminal de TcdA cataliza una reacción de glucotransferasa que transfiere una molécula de glucosa desde UDP-glucosa y la une covalentemente a aminoácidos conservados en moléculas diana. ^{[ 6 ]} Por lo tanto, TcdA cataliza la glucosilación y la posterior inactivación irreversible de moléculas diana de la familia Ras de pequeñas GTPasas. ^{[ 9 ]} Estas moléculas diana incluyen RhoA , Rac y Cdc42 , proteínas reguladoras del citoesqueleto de actina eucariota y moduladoras de diversas vías de señalización celular. ^{[ 7 ]}

TcdA actúa principalmente sobre Rho , Rac y Cdc42 . Estas moléculas son importantes reguladores de la señalización celular. Las pequeñas GTPasas, como Rho, Rac y Cdc42, regulan su actividad alternando entre un estado activo unido a GTP y un estado inactivo unido a GDP . ^{[ 7 ]} Los factores de intercambio de guanina (GEF) regulan el intercambio de GTP y GDP . ^{[ 15 ]}

TcdA glucosila RhoA transfiriendo una molécula de glucosa de la UDP-glucosa , un nucleótido azúcar, a la treonina-37 de la GTPasa RhoA. En Rac y Cdc42, la porción de azúcar se transfiere a la treonina-35. La glucosidación impide la unión adecuada de GTP y bloquea la activación. ^{[ 7 ]} TcdA actúa preferentemente sobre la forma unida a GDP de las proteínas GTPasa, ya que esta configuración expone el residuo de treonina que es glucosidado por la toxina. ^{[ 5 ]}

RhoA regula el citoesqueleto de actina y forma fibras de estrés y adhesiones focales . ^{[ 16 ]} Cuando RhoA se inactiva mediante TcdA, se inhibe su interacción con los efectores posteriores . Esto provoca cambios en el citoesqueleto de actina que aumentan la permeabilidad del epitelio intestinal . Rac y Cdc42 participan en la formación de filopodios, crucial para el movimiento y la migración celular. En general, Rho, Rac y Cdc42 regulan procesos celulares que dependen de la polimerización de actina. Muchos de los efectos fisiológicos que experimentan las células tras la exposición a TcdA pueden vincularse a la desregulación de la polimerización de actina y las vías celulares controladas por los objetivos de TcdA. ^{[ 7 ]}

TcdA y TcdB están presentes en los fluidos sobrenadantes de los cultivos de C. difficile y pueden purificarse a partir de los filtrados. Ambas toxinas se detectan de forma constante en muestras fecales de humanos y animales ^{[ 25 ]} y ahora se utilizan como marcadores para diagnosticar la infección por C. difficile . ^{[ 7 ]} Se encontró que más del 90% de los pacientes infectados con C. difficile tenían actividad citotóxica en sus heces. La glucosilación de las GTPasas Rho inactiva las proteínas GTPasa, lo que lleva al colapso del citoesqueleto, lo que resulta en el redondeamiento celular. Se ha desarrollado un ensayo de cultivo de tejidos para detectar toxinas de C. difficile en muestras de heces. ^{[ 17 ]} Se ha desarrollado un ensayo de redondeamiento celular (ensayo de citotoxicidad) para diagnosticar la infección por C. difficile . ^{[ 11 ]} Se han utilizado ensayos inmunoenzimáticos (ELISA) para detectar TcdA y TcdB con anticuerpos específicos . Cuando se utiliza con un ELISA, el ensayo de citotoxicidad es el "estándar de oro" cuando se utiliza en células Vero para el diagnóstico de C. difficile . ^{[ 11 ]}

Desde los años 80 y principios de los 90, los roles de TcdA y TcdB en la infección por C. difficile han sido objeto de mucho debate. Informes previos con toxinas purificadas indicaron que TcdA por sí sola era suficiente para causar síntomas de infección y que TcdB no podía hacerlo a menos que se combinara con TcdA. ^{[ 7 ]} Un experimento más reciente indicó que TcdB era, de hecho, esencial para la virulencia . ^{[ 26 ]} Investigaciones anteriores establecieron a TcdA estrictamente como una enterotoxina y a TcdB como una citotoxina , pero posteriormente se descubrió que ambas toxinas tenían el mismo mecanismo de acción. ^{[ 6 ]} Para investigar completamente el papel de ambas toxinas en la patogénesis de la infección por C. difficile , se desarrolló un sistema de eliminación de genes en un modelo de infección de hámster. Al eliminar permanentemente tcdA , tcdB o ambos (eliminación doble), se demostró que C. difficile que produce una o ambas toxinas es capaz de ejercer actividad citotóxica, y esta actividad se traduce directamente en virulencia in vivo . También se observó que la eliminación doble de tcdA y tcdB atenúa completamente la virulencia . En resumen, esta investigación ha demostrado la importancia de TcdA y TcdB en la infección por C. difficile , mostrando que cualquiera de las dos toxinas es capaz de ejercer citotoxicidad. ^{[ 9 ]}

• Holina TcdE de C. difficile
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