Ingeniería de cofactores

Se requieren biocatalizadores para la producción de bloques de construcción quirales necesarios en productos farmacéuticos y otros productos químicos utilizados por la sociedad. Muchos de estos biocatalizadores requieren NADPH como cofactor . El NADPH, un cofactor bastante similar al NADH, es más caro y menos estable que su homólogo NADH . Por estas razones, los fabricantes prefieren que los biocatalizadores que utilizan en sus líneas de producción acepten NADH en lugar de NADPH. La ingeniería de cofactores ha tenido éxito recientemente en la modificación de enzimas para que prefieran NADH como cofactor en lugar de NADPH. En 2010, un grupo de científicos realizó ingeniería de cofactores en la enzima Gre2p, una deshidrogenasa que prefiere NADPH que se encuentra en Saccharomyces cerevisiae . Gre2p reduce el compuesto dicetona 2,5-hexanodiona en los bloques de construcción quirales (5S)-hidroxi-2-hexanona y (2S,5S)-hexanodiol. Los científicos determinaron que la Asn9 ( asparagina , posición 9) era un aminoácido importante en el sitio activo de la Gre2p. Específicamente, la Asn9 se une al grupo 3'-hidroxilo y al átomo de oxígeno 2' de la porción de adenil ribosa . Mediante mutagénesis directa , los científicos intercambiaron la Asn9 por Asp ( ácido aspártico ) y Glu ( ácido glutámico ). Este cambio provocó que la Gre2p tuviera una menor dependencia del NADPH y una mayor afinidad por el NADH. Esto resultó en una mayor actividad de la Gre2p al usar NADH. Se observó que la sustitución de la Asn9 por Glu produjo un efecto mayor que el cambio de la Asn9 por Asp. La Asn contiene una cadena lateral polar sin carga, mientras que tanto el Asp como el Glu contienen una cadena lateral polar cargada. El mayor efecto del Glu se debe al carbono adicional en su cadena lateral que lo acerca a la porción de adenil ribosa. Esto permite una mayor unión por enlaces de hidrógeno entre los grupos hidroxilo de la ribosa 2' y 3' y el grupo carboxilo de la cadena lateral. La velocidad máxima de la reacción se duplicó, al usar NADH, cuando se sustituyó Asn9 por Glu. Con estos resultados, los científicos lograron modificar Gre2p para que prefiriera NADH sobre NADPH y aumentar la velocidad de la reducción de 2,5-hexanodiona. Esto permitirá a las empresas químicas reducir sus costos de fabricación al usar NADH en lugar de NADPH, al menos para esta reducción en particular. ^{[ 6 ]}

Un ejemplo alternativo de cómo cambiar la preferencia de una enzima por los cofactores es cambiar una reacción dependiente de NADH a una dependiente de NADPH. En este ejemplo, las enzimas en sí no se modifican, sino que se seleccionan diferentes enzimas que realizan la misma reacción utilizando un cofactor distinto. Se creó una vía metabólica modificada para producir 1-butanol a partir de acetil-CoA mediante la modificación de enzimas en la vía metabólica de S. elongatus . Se sabe que el género Clostridium produce 1-butanol, lo que proporciona una vía que podría insertarse en S. elongatus. Esta vía sintetiza 1-butanol mediante la vía de β-oxidación inversa. Las enzimas implicadas en esta vía modificada eran específicas de NADH, lo que resultó problemático para replicar la vía en S. elongatus, ya que las cianobacterias producen mucho más NADPH que NADH.

El grupo de investigación identificó enzimas que utilizan NADPH o tanto NADPH como NADH mediante bioprospección . Se encontró que la acetoacetil-CoA reductasa (PhaB) era un sustituto adecuado para la hidroxibutirato deshidrogenasa (Hbd). Para reemplazar AdhE2, los investigadores encontraron que la alcohol deshidrogenasa dependiente de NADP (YqhD) de E. coli era eficaz para la vía metabólica. Además, los investigadores necesitaban una deshidrogenasa para reemplazar la capacidad de aldehído deshidrogenasa de AdhE2. Se encontró que la butiraldehído deshidrogenasa acilante de CoA (Bldh) de C. saccharoperbutylacetonicum era adecuada. En conjunto, PhaB, Bldh y YqhD pueden reemplazar a Hbd y AdhE2, respectivamente, para cambiar la preferencia del cofactor de la reducción de 3-cetobutiril-CoA, pasando de usar NADH a usar NADPH. Los autores construyeron diversas combinaciones de las diferentes enzimas (tanto las presentes en la vía de oxidación inversa como las que utilizan NADPH) mediante la sobreexpresión de distintos genes en cultivos de S. elongatus PCC 7942. Para ello, construyeron plásmidos que contenían los genes correspondientes a las enzimas y los integraron en el genoma de S. elongatus. Tras realizar ensayos enzimáticos, la cepa de cianobacteria que expresaba las enzimas que utilizan NADPH produjo la mayor cantidad de 1-butanol (29,9  mg/L), superando en cuatro veces la de las cepas que no contenían dichas enzimas. En resumen, S. elongatus produjo 1-butanol utilizando una vía metabólica de otro organismo. Esta vía se modificó para adaptarla al cofactor reductor preferido de la cianobacteria. ^{[ 7 ]}

En la ingeniería de cofactores, una vía metabólica se altera cambiando las concentraciones de cofactores específicos que se producen en esa vía en particular o en una vía separada. Por ejemplo, un organismo hipotético podría tener dos vías arbitrarias llamadas A y B, donde algunas enzimas en ambas utilizan los mismos cofactores. Si los científicos quisieran disminuir la producción de la vía A, podrían considerar primero la ingeniería directa de las enzimas involucradas en A, tal vez para disminuir la afinidad de un sitio activo particular por su sustrato . Sin embargo, en algunos casos, las enzimas de A pueden ser difíciles de modificar por diversas razones, o puede ser imposible modificarlas sin afectar peligrosamente alguna tercera vía metabólica C, que utiliza las mismas enzimas. Como opción alternativa, los científicos podrían aumentar el flujo de B, lo cual podría ser más fácil de modificar. Esto, a su vez, podría "bloquear" los cofactores necesarios para A, lo que ralentizaría la actividad enzimática y disminuiría la producción de A. Este es un ejemplo hipotético de cómo se puede utilizar la ingeniería de cofactores, pero existen muchos otros casos singulares en los que los científicos utilizan cofactores para alterar las vías metabólicas. Una ventaja importante de la ingeniería de cofactores es que permite a los científicos modificar con éxito vías metabólicas difíciles de modificar mediante la ingeniería metabólica convencional. Esto se logra seleccionando enzimas más fáciles de modificar en vías separadas, que utilizan los mismos cofactores. Dado que muchos cofactores son utilizados por diferentes enzimas en múltiples vías, la ingeniería de cofactores puede ser una alternativa eficiente y rentable a los métodos actuales de ingeniería metabólica. ^{[ 8 ]}

Las levaduras se utilizan comúnmente en la industria cervecera y vinícola debido a su capacidad para producir etanol de manera eficiente mediante la fermentación, una vía metabólica que requiere oxígeno. La fermentación requiere la enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (GPDH), la cual depende del cofactor NADH . Esta vía metabólica implica la conversión de glucosa en etanol y glicerol , ambos compuestos que utilizan NADH como cofactor . Los científicos modificaron genéticamente Saccharomyces cerevisiae para sobreproducir GPDH, lo que desvió el flujo metabólico celular del etanol hacia el glicerol, al limitar la disponibilidad de NADH en la etapa de producción de etanol de la vía. El efecto opuesto se logró influyendo en otra vía metabólica celular: la vía de síntesis de glutamato . La inactivación de la expresión de la enzima glutamato deshidrogenasa , dependiente de NADPH , y la sobreexpresión de las enzimas glutamina sintetasa y glutamato sintetasa , que dependen de NADH como cofactor, alteraron el equilibrio de cofactores en la vía de síntesis de glutamato. La vía metabólica ahora depende de NADH en lugar de NADPH, lo que disminuye la disponibilidad de NADH en la vía de fermentación. Esto, a su vez, provoca un aumento en la producción de etanol y una disminución en la producción de glicerol . Este método de manipulación de los flujos metabólicos podría visualizarse de forma similar a los mercados mundiales de combustibles, donde el aumento de la producción de etanol para su uso en la industria automotriz disminuiría su disponibilidad en la industria alimentaria. En esencia, producir más motores que funcionen con etanol podría resultar en una disminución del consumo de dulces procesados, que contienen jarabe de maíz de alta fructosa . Esta ingeniería de cofactores es aplicable a la industria cervecera y vinícola, ya que permite regular los niveles de etanol en las bebidas alcohólicas. Los avances en la industria vitivinícola han provocado un aumento constante en el contenido de etanol, por lo que los enólogos, en particular, estarían interesados ​​en la posibilidad de reducir los niveles de etanol de algunos de sus vinos. ^{[ 3 ]}

La coenzima A (CoA) y la acetil-CoA son dos metabolitos intermedios , presentes principalmente en el ciclo del ácido cítrico , que participan en más de 100 reacciones diferentes del metabolismo de los microorganismos. Experimentos recientes han demostrado que la sobreexpresión de la enzima pantotenato quinasa y la suplementación con ácido pantoténico en la vía de biosíntesis de CoA han permitido ajustar los flujos de CoA y acetil-CoA. Esta mayor concentración de cofactores resultó en un mayor flujo de carbono en la vía de síntesis de acetato de isoamilo , aumentando la eficiencia de producción de acetato de isoamilo. El acetato de isoamilo se utiliza industrialmente como saborizante artificial y para evaluar la eficacia de los respiradores . Además de la producción de acetato de isoamilo, la manipulación de la biosíntesis de CoA durante la reacción de la piruvato hidrogenasa también provoca un aumento en la producción de succinato y licopeno , compuestos con efectos beneficiosos para el organismo humano. Un aumento en la concentración de succinato, que se utiliza como catalizador , puede conducir a un aumento en la velocidad del ciclo del ácido cítrico y, por consiguiente, del metabolismo de un individuo . Se ha demostrado que el aumento de las concentraciones de licopeno disminuye el riesgo de cáncer de próstata . Las posibles recompensas de repetir esta hazaña de ingeniería de cofactores e incorporarla con éxito a las prácticas industriales son innumerables. ^{[ 4 ] [ 9 ] [ 10 ]}

Muchas enzimas industriales importantes utilizan cofactores para catalizar reacciones. Al usar cofactores para manipular las vías metabólicas , es posible reducir el costo de los materiales, eliminar pasos en la producción, reducir el tiempo de producción, disminuir la contaminación y aumentar la eficiencia general de la producción. Un caso que demuestra varios de estos beneficios de fabricación involucra la ingeniería genética de los álamos . En el proceso de producción de papel, las plantas de fabricación deben descomponer la lignina , un compuesto bioquímico que le da rigidez al tronco del árbol, para formar la pulpa que se usa en el resto de la producción. El proceso de pulpado químico requiere que la planta de fabricación utilice una cantidad significativa de energía, así como muchos productos químicos costosos y tóxicos. Un grupo de ingenieros genéticos, mediante ingeniería de cofactores , diseñó un álamo genéticamente superior que producía menos lignina. Estos árboles genéticamente modificados han permitido a las fábricas de papel reducir sus costos, la contaminación y el tiempo de fabricación. ^{[ 1 ] [ 11 ]}