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Articulo de referencia

Microscopía de dispersión Raman coherente

Imágenes simultáneas de dispersión Raman estimulada sin marcadores de dos colores en pila Z de la oreja de un ratón (rojo: proteína, verde: lípido, la imagen es de 220 por 220 m...

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Imágenes simultáneas de dispersión Raman estimulada sin marcadores de dos colores en pila Z de la oreja de un ratón (rojo: proteína, verde: lípido, la imagen es de 220 por 220 micras, la profundidad total es de 60 micras, el tiempo de permanencia del píxel es de 2 microsegundos).

La microscopía de dispersión Raman coherente (CRS) es una técnica de microscopía multifotónica basada en los modos vibracionales activos Raman de las moléculas . Las dos técnicas principales en la microscopía CRS son la dispersión Raman estimulada (SRS) y la dispersión Raman anti-Stokes coherente (CARS) . SRS y CARS fueron predichas teóricamente y realizadas experimentalmente en la década de 1960. [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] En 1982 se demostró el primer microscopio CARS. [ 4 ] En 1999, la microscopía CARS utilizando una geometría colineal y un objetivo de alta apertura numérica se desarrolló en el laboratorio de Xiaoliang Sunney Xie en la Universidad de Harvard . [ 5 ] Este avance hizo que la técnica fuera más compatible con los microscopios de escaneo láser modernos . [ 6 ] Desde entonces, la popularidad de CRS en la investigación biomédica comenzó a crecer. La espectroscopia Raman de reflectancia difusa (CRS) se utiliza principalmente para obtener imágenes de lípidos, proteínas y otras biomoléculas en células o tejidos vivos o fijados, sin necesidad de marcaje ni tinción . [ 7 ] La CRS también puede utilizarse para obtener imágenes de muestras marcadas con etiquetas Raman, [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] lo que evita la interferencia de otras moléculas y normalmente permite obtener señales CRS más intensas que las que se obtendrían habitualmente para biomoléculas comunes. La CRS también encuentra aplicación en otros campos, como la ciencia de los materiales [ 12 ] y las ciencias ambientales. [ 13 ]

Fondo

Diagramas de energía de los procesos de dispersión Raman espontánea y coherente.

La dispersión Raman coherente se basa en la dispersión Raman (o dispersión Raman espontánea). En la dispersión Raman espontánea, se utiliza un único láser de excitación monocromático. La intensidad de la señal de la dispersión Raman espontánea aumenta linealmente con la potencia media de un láser de bombeo de onda continua . En la dispersión Raman coherente (CRS), [ 7 ] se utilizan dos láseres para excitar modos vibracionales específicos de las moléculas que se van a visualizar. El láser con mayor energía fotónica se denomina normalmente láser de bombeo y el láser con menor energía fotónica se denomina láser Stokes. Para producir una señal, sus diferencias de energía fotónica deben coincidir con la energía de un modo vibracional.

miRametroanorte=mipagtúmetropag−miStokmis{\ Displaystyle E_ {Raman} = E_ {bomba} -E_ {Stokes}},

donde elmiRametroanorte=ℏΩ, mipagtúmetropag=ℏωpagtúmetropag, miStokmis=ℏωStokmis{\displaystyle E_{Raman}=\hbar \Omega ,\ E_{pump}=\hbar \omega _{pump},\ E_{Stokes}=\hbar \omega _{Stokes}}.

La espectroscopia Raman de reflexión (CRS) es un proceso óptico no lineal , donde el nivel de señal normalmente es función del producto de las potencias de los láseres de bombeo y Stokes. Por lo tanto, la mayoría de los experimentos de microscopía CRS se realizan con láseres pulsados , donde una mayor potencia pico mejora significativamente los niveles de señal de la CRS. [ 14 ]

Microscopía de dispersión Raman anti-Stokes coherente (CARS)

CARS con detección directa y epi

En CARS, los fotones anti-Stokes (de mayor energía y menor longitud de onda que el pulso de bombeo) se detectan como señales.

midoARS=mipagtúmetropag+Ω=2×mipagtúmetropag−miStokmis{\displaystyle E_{CARS}=E_{pump}+\Omega =2\times E_{pump}-E_{Stokes}}

En la microscopía CARS, normalmente existen dos formas de detectar los fotones recién generados. Una se denomina CARS de detección frontal y la otra CARS de detección epifluorescente. [ 15 ] [ 16 ] En la CARS de detección frontal, los fotones CARS generados, junto con los láseres de bombeo y Stokes, atraviesan la muestra. Los láseres de bombeo y Stokes se bloquean completamente mediante un filtro de muesca de alta densidad óptica (DO) . Los fotones CARS se detectan entonces mediante un tubo fotomultiplicador (PMT) o una cámara CCD . En la CARS de detección epifluorescente, los fotones CARS retrodispersados ​​se redirigen mediante un espejo dicroico o un divisor de haz polarizador . Tras utilizar filtros de alta DO para bloquear los láseres de bombeo y Stokes retrodispersados, los fotones recién generados se detectan mediante un PMT. La intensidad de la señal CARS tiene la siguiente relación con las intensidades de los láseres de bombeo y Stokes:Ipagtúmetropag,IStokmis{\displaystyle I_{pump},I_{Stokes}}, el número de moléculasnorte{\displaystyle N}en el foco de los láseres y la susceptibilidad Raman de tercer ordenχRametroanorte(3){\displaystyle \chi _{Raman}^{(3)}}de la molécula: [ 17 ]

IdoARS∝(norteχRametroanorte(3))2Ipagtúmetropag2IStokmis{\displaystyle I_{CARS}\propto (N\chi _{Raman}^{(3)})^{2}I_{pump}^{2}I_{Stokes}}

La relación señal-ruido (SNR), que es una característica más importante en los experimentos de imagen, depende de la raíz cuadrada del número de fotones CARS generados, que se indica a continuación: [ 17 ]

SnorteRdoARS∝norteχRametroanorte(3)IpagtúmetropagIStokmis{\displaystyle SNR_{CARS}\propto N\chi _{Raman}^{(3)}I_{pump}{\sqrt {I_{Stokes}}}}

Existen otros procesos ópticos no lineales que también generan fotones en la longitud de onda anti-Stokes. Estas señales se denominan normalmente fondo de mezcla de cuatro ondas (FWM) no resonante (NR) en microscopía CARS. Este fondo puede interferir con la señal CARS de forma constructiva o destructiva. [ 18 ] Sin embargo, el problema puede mitigarse parcialmente restando las imágenes en resonancia y fuera de resonancia [ 19 ] [ 20 ] o utilizando métodos matemáticos para recuperar las imágenes libres de fondo. [ 21 ]

Microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS)

En SRS, la intensidad de la transferencia de energía desde la longitud de onda de bombeo a la longitud de onda del láser Stokes se mide como una señal. Hay dos maneras de medir las señales SRS: una es medir el aumento de potencia en el láser Stokes, que se denomina ganancia Raman estimulada (SRG). La otra es medir la disminución de potencia en el láser de bombeo, que se denomina pérdida Raman estimulada (SRL). Dado que el cambio de potencia es del orden de 10⁻³ a 10⁻⁶ en comparación con la potencia original de los láseres de bombeo y Stokes, normalmente se emplea un esquema de transferencia de modulación [ 22 ] para extraer las señales SRS. [ 23 ] La señal SRS depende de las potencias de los láseres de bombeo y Stokes de la siguiente manera:

ISRS∝norteχRametroanorte(3)IpagtúmetropagIStokmis{\displaystyle I_{SRS}\propto N\chi _{Raman}^{(3)}I_{pump}I_{Stokes}}

La detección limitada por ruido de disparo se puede lograr si el ruido electrónico de los detectores se reduce muy por debajo del ruido óptico y los láseres están limitados por ruido de disparo en la frecuencia de detección (frecuencia de modulación). En el caso limitado por ruido de disparo, la relación señal-ruido (SNR) de SRS [ 17 ] es

SnorteRSRL∝norteχRametroanorte(3)IpagtúmetropagIStokmis{\displaystyle SNR_{SRL}\propto N\chi _{Raman}^{(3)}{\sqrt {I_{pump}}}I_{Stokes}}

SnorteRSRGRAMO∝norteχRametroanorte(3)IpagtúmetropagIStokmis{\displaystyle SNR_{SRG}\propto N\chi _{Raman}^{(3)}I_{pump}{\sqrt {I_{Stokes}}}}

La señal de SRS está libre del fondo no resonante que afecta a la microscopía CARS, aunque puede existir un fondo no resonante mucho menor procedente de otros procesos ópticos (por ejemplo, modulación de fase cruzada , absorción multifotónica multicolor ).

La SRS se puede detectar tanto en la dirección frontal como en la dirección epifluorescente. En la SRS con detección frontal, el láser modulado se bloquea mediante un filtro de muesca de alta densidad óptica y el otro láser se mide con un fotodiodo. La modulación transferida del láser modulado al láser originalmente no modulado se extrae normalmente mediante un amplificador lock-in a partir de la salida del fotodiodo. En la SRS con detección epifluorescente, normalmente existen dos métodos para detectar la señal SRS. Un método consiste en detectar la luz retrodispersada delante del objetivo mediante un fotodiodo con un orificio en el centro. El otro método es similar a la microscopía CARS con detección epifluorescente, donde la luz retrodispersada atraviesa el objetivo y se desvía hacia un lado de la trayectoria de la luz, normalmente con la combinación de un divisor de haz polarizador y una lámina de cuarto de onda. El láser Stokes (o de bombeo) se detecta después de filtrarlo.

Microscopía CRS de dos colores, multicolor e hiperespectral

Un par de longitudes de onda láser solo da acceso a una única frecuencia vibracional. La obtención de imágenes de muestras en diferentes números de onda puede proporcionar un mapeo químico más específico y cuantitativo de la muestra. [ 24 ] [ 25 ] [ 26 ] [ 27 ] [ 28 ] [ 29 ] Esto se puede lograr mediante la obtención de imágenes en diferentes números de onda uno tras otro. Esta operación siempre implica algún tipo de ajuste: ajuste de una de las longitudes de onda de los láseres, ajuste de un dispositivo de filtrado espectral o ajuste del retardo de tiempo entre los láseres de bombeo y Stokes en el caso de CRS de enfoque espectral. Otra forma de realizar CRS multicolor es utilizar un láser de picosegundos con un ancho de banda espectral estrecho (<1  nm) como bombeo o Stokes y el otro láser con un ancho de banda espectral amplio. En este caso, el espectro del láser de banda ancha transmitido se puede dispersar mediante una rejilla y medir mediante una matriz de detectores.

CRS de enfoque espectral

Los sistemas CRS normalmente utilizan láseres con ancho de banda estrecho, cuyo ancho de banda < 1  nm, para mantener una buena resolución espectral de ~ 15  cm −1 . Los láseres con un ancho de banda inferior a 1 nm son láseres de picosegundos. En los sistemas CRS de enfoque espectral, los láseres de bombeo y Stokes de femtosegundos se modulan  linealmente en picosegundos. [ 30 ] [ 31 ] [ 32 ] El ancho de banda efectivo se reduce y, por lo tanto, se puede lograr una alta resolución espectral de esta manera con láseres de femtosegundos que normalmente tienen un ancho de banda amplio. La sintonización del número de onda de los sistemas CRS de enfoque espectral se puede lograr tanto cambiando la longitud de onda central de los láseres como cambiando el retardo entre los láseres de bombeo y Stokes.

Aplicaciones

Histología Raman coherente

Comparación de una tinción tradicional de hematoxilina y eosina con ácidos nucleicos en azul violáceo y matriz extracelular y citoplasma en rosa (izquierda) y una imagen de histología Raman coherente con proteínas marcadas en rojo y lípidos marcados en verde (derecha). En la histología Raman coherente, se pueden apreciar con mayor claridad características específicas, como las membranas lipídicas.

Una de las principales aplicaciones de CRS es la histología sin marcadores , también llamada histología Raman coherente o, a veces, histología Raman estimulada. [ 33 ] [ 34 ] [ 35 ] [ 36 ] [ 37 ] [ 38 ] En CRH, las imágenes CRS se obtienen en el tejido a frecuencias vibracionales características de lípidos y proteínas. Mediante el procesamiento computacional de imágenes, estas imágenes se fusionan para producir una imagen similar a la histología, comparable a la tinción convencional de H&E . [ 37 ] [ 38 ] A diferencia de la tinción de H&E, CRH se puede realizar con poco tiempo de preparación y mínima destrucción del tejido, lo que permite el uso de tejido vivo y fresco sin fijación ni tinción. [ 38 ]

Metabolismo celular

El metabolismo de moléculas pequeñas como la glucosa, [ 39 ] [ 40 ] el colesterol, [ 41 ] y los fármacos [ 42 ] se estudia con CRS en células vivas. La CRS proporciona una forma de medir la distribución y las cantidades moleculares con un rendimiento relativamente alto. [ 43 ] Por ejemplo, se desarrolló un método de imagen SRS de dos colores que rastreaba simultáneamente la captación e incorporación de glucosa en células vivas con posibles aplicaciones en el cáncer. [ 43 ]

Imágenes de mielina

La mielina es rica en lípidos y, por lo tanto, las imágenes CRS se pueden obtener a frecuencias vibracionales características de los lípidos. La CRS se utiliza de forma rutinaria para obtener imágenes de la mielina en tejidos vivos o fijados para estudiar enfermedades neurodegenerativas u otros trastornos neuronales. [ 44 ] [ 45 ] [ 46 ] Algunos ejemplos incluyen un método CRS para estudiar la ELA [ 47 ] y la enfermedad de Huntington . [ 48 ]

Investigación farmacéutica

Las funciones de los fármacos también pueden estudiarse mediante CRS. Por ejemplo, el fármaco antileucémico imatinib se estudia con SRS en líneas celulares de leucemia. [ 42 ] El estudio reveló el posible mecanismo de su metabolismo en las células y proporcionó información sobre cómo mejorar la eficacia del fármaco.

Etiquetas Raman

Las etiquetas Raman comunes (combinaciones de alquinos y nitrilos) producen diferentes espectros Raman y, por lo tanto, pueden proporcionar imágenes celulares multicolor cuando se unen a diversas moléculas.

Aunque la espectroscopia Raman de reflectancia difusa (CRS) permite la obtención de imágenes sin marcadores, también se pueden utilizar marcadores Raman para potenciar la señal de objetivos específicos. [ 49 ] [ 9 ] [ 8 ] Por ejemplo, se utilizan moléculas deuteradas para desplazar la señal Raman a una banda donde no hay interferencia de otras moléculas. Los grupos funcionales alquino y nitrilo también son comunes. Se pueden utilizar moléculas especialmente diseñadas como marcadores Raman para lograr imágenes multicolor supermultiplexadas con espectroscopia Raman de dispersión estimulada (SRS). [ 10 ] [ 50 ]

Comparación con la microscopía Raman confocal

La microscopía Raman confocal normalmente utiliza láseres de onda continua para proporcionar un espectro Raman espontáneo en un amplio rango de números de onda para cada punto de una imagen. El escaneo de toda la muestra lleva mucho tiempo, ya que cada píxel requiere segundos para la adquisición de datos. Todo el proceso de obtención de imágenes es largo y, por lo tanto, es más adecuado para muestras que no se mueven. Por otro lado, la espectroscopia Raman confocal (CRS) mide señales en un solo número de onda, pero permite un escaneo rápido. Si se necesita más información espectral, se puede utilizar CRS multicolor o hiperespectral, lo que comprometerá la velocidad de escaneo o la calidad de los datos . [ 51 ]

Comparación entre SRS y CARS

En la microscopía CRS, podemos considerar SRS y CARS como dos aspectos del mismo proceso. La señal CARS siempre se mezcla con un fondo de mezcla de cuatro ondas no resonante y presenta una dependencia cuadrática de la concentración de las sustancias químicas que se están visualizando. SRS tiene un fondo mucho menor y depende linealmente de la concentración de la sustancia química que se está visualizando. Por lo tanto, SRS es más adecuada para la obtención de imágenes cuantitativas que CARS. En cuanto a la instrumentación, SRS requiere modulación y demodulación (por ejemplo, un amplificador lock-in o un detector resonante). Para la obtención de imágenes multicanal, SRS requiere demodulación multicanal, mientras que CARS solo necesita una matriz PMT o un CCD. Por consiguiente, la instrumentación requerida es más compleja para SRS que para CARS. [ 17 ]

En cuanto a la sensibilidad, SRS y CARS suelen ofrecer sensibilidades similares. [ 52 ] Sus diferencias se deben principalmente a los métodos de detección. En la microscopía CARS, se utilizan PMT, APD o CCD como detectores para detectar los fotones generados en el proceso CARS. Los PMT son los más utilizados debido a su gran área de detección y alta velocidad. En la microscopía SRS, se suelen utilizar fotodiodos para medir la intensidad del haz láser. Debido a estas diferencias, las aplicaciones de CARS y SRS también son diferentes. [ 17 ]

Los PMT normalmente tienen una eficiencia cuántica relativamente baja en comparación con los fotodiodos. Esto afectará negativamente la relación señal-ruido (SNR) de la microscopía CARS. Los PMT también tienen una sensibilidad reducida para láseres con longitudes de onda mayores de 650  nm. Por lo tanto, con el sistema láser comúnmente utilizado para CRS ( láser de zafiro de titanio ), CARS se utiliza principalmente para obtener imágenes en la región de alto número de onda (2800–3400  cm⁻¹ ). La SNR de la microscopía CARS suele ser baja para la obtención de imágenes de huellas dactilares (400–1800 cm⁻¹ ). [ 17 ] 

La microscopía SRS utiliza principalmente fotodiodos de silicio como detectores. Los fotodiodos de Si tienen una eficiencia cuántica mucho mayor que los PMT, lo que explica en parte por qué la relación señal-ruido (SNR) de SRS puede ser mejor que la de CARS en muchos casos. Los fotodiodos de Si también sufren una sensibilidad reducida cuando la longitud de onda del láser supera los 850 nm  . Sin embargo, la sensibilidad sigue siendo relativamente alta y permite la obtención de imágenes en la región de huella dactilar (400–1800  cm⁻¹ ). [ 17 ]

Véase también

Referencias

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