Microscopio Raman

El microscopio Raman es un dispositivo microscópico basado en láser que se utiliza para realizar espectroscopia Raman . ^[1] El término MOLE (examinador láser de óptica molecular) se utiliza para referirse a la microsonda basada en Raman. ^[1] La técnica utilizada recibe su nombre de CV Raman , quien descubrió las propiedades de dispersión en los líquidos. ^[2]

El microscopio Raman comienza con un microscopio óptico estándar y agrega un láser de excitación , filtros de rechazo láser , un espectrómetro o monocromador y un detector óptico sensible como un dispositivo acoplado a carga (CCD) o un tubo fotomultiplicador (PMT). Tradicionalmente, la microscopía Raman se utilizaba para medir el espectro Raman de un punto en una muestra; más recientemente, la técnica se ha extendido para implementar la espectroscopía Raman para la obtención de imágenes químicas directas en todo el campo de visión de una muestra 3D .

En la obtención de imágenes directas , se examina todo el campo de visión para detectar la dispersión en un rango pequeño de números de onda (desplazamientos Raman). Por ejemplo, se podría utilizar una característica de número de onda para el colesterol para registrar la distribución del colesterol dentro de un cultivo celular. El otro enfoque es la obtención de imágenes hiperespectrales o imágenes químicas , en las que se adquieren miles de espectros Raman de todo el campo de visión. Los datos se pueden utilizar para generar imágenes que muestren la ubicación y la cantidad de diferentes componentes. Tomando el ejemplo del cultivo celular, una imagen hiperespectral podría mostrar la distribución del colesterol, ^[3] así como de las proteínas, los ácidos nucleicos y los ácidos grasos. ^{[4] [5] [6]} Se pueden utilizar técnicas sofisticadas de procesamiento de señales e imágenes para ignorar la presencia de agua, medios de cultivo, tampones y otras interferencias.

La microscopía Raman, y en particular la microscopía confocal , puede alcanzar una resolución espacial lateral submicrométrica. ^[7] Debido a que un microscopio Raman es un sistema limitado por difracción , su resolución espacial depende de la longitud de onda de la luz y de la apertura numérica del elemento de enfoque. En la microscopía Raman confocal, el diámetro de la apertura confocal es un factor adicional. Como regla general, la resolución espacial lateral puede alcanzar aproximadamente la longitud de onda del láser cuando se utilizan lentes objetivos de aire, mientras que los objetivos de inmersión en aceite o agua pueden proporcionar resoluciones laterales de alrededor de la mitad de la longitud de onda del láser. Esto significa que cuando se opera en el rango visible al infrarrojo cercano, un microscopio Raman puede lograr resoluciones laterales de aproximadamente 1 µm hasta 250 nm, mientras que la resolución de profundidad (si no está limitada por la profundidad de penetración óptica de la muestra) puede variar de 1 a 6 µm con la apertura de orificio confocal más pequeña hasta decenas de micrómetros cuando se opera sin un orificio confocal. ^{[8] [9] [10]} Dado que las lentes objetivas de los microscopios enfocan el haz láser hasta el rango micrométrico, el flujo de fotones resultante es mucho mayor que el logrado en configuraciones Raman convencionales. Esto tiene el efecto adicional de aumentar el fotoblanqueo de moléculas que emiten fluorescencia interferente. Sin embargo, el alto flujo de fotones también puede causar degradación de la muestra y, por lo tanto, para cada tipo de muestra, la longitud de onda y la potencia del láser deben seleccionarse cuidadosamente.

Otra herramienta que se está volviendo más popular es la imagen global Raman. Esta técnica se está utilizando para la caracterización de dispositivos a gran escala, el mapeo de diferentes compuestos y el estudio de la dinámica. Ya se ha utilizado para la caracterización de capas de grafeno , ^[11] colorantes agregados con J dentro de nanotubos de carbono y muchos otros materiales 2D como MoS ₂ ^[12] y WSe ₂ . Dado que el haz de excitación se dispersa por todo el campo de visión, esas mediciones se pueden realizar sin dañar la muestra. Al utilizar la microespectroscopia Raman, se pueden medir espectros Raman in vivo resueltos en el tiempo y el espacio de regiones microscópicas de muestras. Como resultado, se puede eliminar la fluorescencia del agua, los medios y los tampones. En consecuencia, es adecuado para examinar proteínas, células y orgánulos.

La microscopía Raman para muestras biológicas y médicas generalmente utiliza láseres de infrarrojo cercano (NIR) ( los diodos de 785 nm y Nd:YAG de 1064 nm son especialmente comunes). Esto reduce el riesgo de dañar la muestra al aplicar longitudes de onda de mayor energía. Sin embargo, la intensidad de la dispersión Raman NIR es baja (debido a la dependencia de ω ⁴ de la intensidad de dispersión Raman), y la mayoría de los detectores requieren tiempos de recolección muy largos. Recientemente, se han puesto a disposición detectores más sensibles, lo que hace que la técnica sea más adecuada para el uso general. La microscopía Raman de muestras inorgánicas, como rocas, cerámicas y polímeros, ^[13] puede utilizar un rango más amplio de longitudes de onda de excitación.

Una técnica relacionada, la espectroscopia Raman mejorada con punta , puede producir imágenes hiperespectrales de alta resolución de moléculas individuales ^[14] y ADN. ^[15]

La microscopía confocal Raman se puede combinar con numerosas técnicas de microscopía. Al utilizar diferentes métodos y correlacionar los datos, el usuario obtiene una comprensión más completa de la muestra. Ejemplos comunes de técnicas de microscopía correlativa son Raman-AFM , ^{[16] [13]} Raman- SNOM , ^[17] y Raman- SEM . ^[18]

La formación de imágenes SEM-Raman correlativas es la integración de un microscopio Raman confocal en una cámara SEM que permite la formación de imágenes correlativas de varias técnicas, como SE, BSE, EDX , EBSD , EBIC , CL , AFM . ^[19] La muestra se coloca en la cámara de vacío del microscopio electrónico. Ambos métodos de análisis se realizan automáticamente en la misma ubicación de la muestra. Las imágenes SEM y Raman obtenidas se pueden superponer. ^{[20] [21]} Además, añadir un haz de iones enfocado (FIB) en la cámara permite la eliminación del material y, por lo tanto, la formación de imágenes en 3D de la muestra. El modo de bajo vacío permite el análisis de muestras biológicas y no conductoras.

Mediante el uso de la microespectroscopia Raman, se pueden medir espectros Raman in vivo resueltos en el tiempo y el espacio de regiones microscópicas de muestras. El muestreo no es destructivo y el agua, los medios y los tampones normalmente no interfieren con el análisis. En consecuencia, la espectroscopia Raman in vivo resuelta en el tiempo y el espacio es adecuada para examinar proteínas , células y órganos . En el campo de la microbiología, la microespectroscopia Raman confocal se ha utilizado para mapear distribuciones intracelulares de macromoléculas, como proteínas, polisacáridos y ácidos nucleicos e inclusiones poliméricas, como ácido poli-β-hidroxibutírico y polifosfatos en bacterias y esteroles en microalgas. La combinación de experimentos de sondeo isotópico estable (SIP) con microespectroscopia Raman confocal ha permitido la determinación de las tasas de asimilación de sustratos de ¹³ C y ¹⁵ N, así como de D ₂ O por células bacterianas individuales. ^[22]

• Dispersión Raman
• Microscopía de dispersión Raman coherente
• Microscopio electrónico de barrido
• Espectroscopia Raman con punta mejorada