Unidad formadora de colonias

En microbiología , una unidad formadora de colonias ( UFC ) es una unidad que estima el número de células microbianas ( bacterias , hongos , virus , etc.) en una muestra que son viables y capaces de multiplicarse por fisión binaria en condiciones controladas. La determinación de las unidades formadoras de colonias requiere el cultivo de los microorganismos y el recuento únicamente de las células viables, a diferencia del examen microscópico, que cuenta todas las células, vivas o muertas. La apariencia visual de una colonia en un cultivo celular requiere un crecimiento significativo, y al contar colonias, no se puede determinar con certeza si la colonia se originó a partir de una sola célula o de un grupo de células. Expresar los resultados como unidades formadoras de colonias refleja esta incertidumbre.

El propósito del recuento en placa es estimar el número de células presentes en función de su capacidad para formar colonias bajo condiciones específicas de temperatura, tiempo y medio de cultivo. Teóricamente, una célula viable puede dar origen a una colonia mediante replicación. Sin embargo, las células solitarias son la excepción en la naturaleza, y en la mayoría de los casos el progenitor de una colonia es una masa de células depositadas juntas. ^{[ 1 ] [ 2 ]} Además, muchas bacterias crecen en cadenas (p. ej. , Streptococcus ) o en cúmulos (p. ej., Staphylococcus ). Por estas razones, la estimación del número de microorganismos mediante UFC subestimará, en la mayoría de los casos, el número de células vivas presentes en una muestra. ^{[ 3 ]}

Normalmente, se realizan diluciones seriadas de diez veces de las muestras para asegurar que produzcan un número contable de colonias. ^{[ 4 ] [ 5 ]} Los volúmenes de siembra generalmente oscilan entre 100  μL y 1  mL. ^{[ 5 ]} Se cuentan las colonias en la placa y luego se calcula la UFC/g (o UFC/mL) de la muestra original en función del volumen sembrado y el factor de dilución.

Una ventaja de este método es que diferentes especies microbianas pueden dar lugar a colonias claramente distintas entre sí, tanto microscópica como macroscópicamente . La morfología de la colonia puede ser de gran utilidad para la identificación del microorganismo presente. ^{[ 6 ]}

Un conocimiento previo de la anatomía microscópica del organismo puede brindar una mejor comprensión de cómo se relaciona la UFC/mL observada con el número de células viables por mililitro. Alternativamente, en algunos casos es posible disminuir el número promedio de células por UFC agitando la muestra en un vórtex antes de realizar la dilución. Sin embargo, muchos microorganismos son delicados y sufrirían una disminución en la proporción de células viables al ser sometidos a agitación en vórtex. ^{[ 7 ]}

Las unidades formadoras de colonias se utilizan para cuantificar los resultados en muchos métodos de siembra y recuento microbiológico, entre ellos:

• El método de vertido en placa consiste en suspender la muestra en una placa de Petri utilizando agar fundido enfriado a aproximadamente 40–45  °C (justo por encima del punto de solidificación para minimizar la muerte celular inducida por el calor). Una vez solidificado el agar nutritivo, se incuba la placa. ^{[ 11 ]}
• El método de siembra en placa consiste en extender la muestra (en un volumen pequeño) sobre la superficie de una placa de agar nutritivo y dejarla secar antes de la incubación para el recuento. ^{[ 11 ]}
• El método de filtración por membrana consiste en filtrar la muestra a través de un filtro de membrana, que luego se coloca sobre la superficie de una placa de agar nutritivo. Durante la incubación, los nutrientes se filtran a través del filtro para sustentar el crecimiento celular. Dado que la superficie de la mayoría de los filtros es menor que la de una placa de Petri estándar, el rango lineal del recuento en placa será menor. ^{[ 11 ]}
• El método de Miles y Misra, o método de gota a gota, consiste en depositar una alícuota muy pequeña (generalmente unos 10 microlitros) de muestra de cada dilución en serie sobre una placa de Petri. La placa debe leerse cuando las colonias son muy pequeñas para evitar la pérdida de UFC a medida que crecen juntas. ^{[ 12 ]}

Sin embargo, con las técnicas que requieren el uso de una placa de agar, no se puede utilizar ninguna solución líquida porque no se puede identificar la pureza de la muestra y no es posible contar las células una por una en el líquido. ^{[ 13 ]}

El recuento de colonias se realiza tradicionalmente de forma manual con un bolígrafo y un contador de clics. Generalmente es una tarea sencilla, pero puede volverse muy laboriosa y consumir mucho tiempo cuando hay que enumerar muchas placas. Como alternativa, se pueden utilizar soluciones semiautomáticas (software) y automáticas (hardware + software). ^{[ 14 ] [ 15 ] [ 16 ]}

Sistemas automatizados

Muchos de los sistemas automatizados se utilizan para contrarrestar el error humano, ya que muchas de las técnicas de investigación que realizan los humanos al contar células individuales tienen una alta probabilidad de error. Debido a que los investigadores suelen contar las células manualmente con la ayuda de luz transmitida, esta técnica propensa a errores puede tener un efecto significativo en la concentración calculada en el medio líquido principal cuando el número de células es bajo. ^{[ 24 ]}

Algunos fabricantes de biotecnología también ofrecen sistemas completamente automatizados. ^{[ 25 ] [ 26 ]} Generalmente son costosos y no tan flexibles como el software independiente, ya que el hardware y el software están diseñados para funcionar juntos en una configuración específica. ^{[ 18 ]} Como alternativa, algunos sistemas automáticos utilizan el paradigma de siembra en espiral . ^{[ 27 ]}

Algunos sistemas automatizados, como los de MATLAB, permiten contar las células sin necesidad de teñirlas. Esto posibilita la reutilización de las colonias en otros experimentos sin el riesgo de matar los microorganismos con tinciones. Sin embargo, una desventaja de estos sistemas automatizados es la extrema dificultad para diferenciar los microorganismos con polvo o arañazos en placas de agar sangre, ya que tanto el polvo como los arañazos pueden generar una gran diversidad de formas y apariencias. ^{[ 28 ]}

• recuento de células
• Medio de cultivo
• Método de Miles y Misra
• Número más probable
• Chapado de réplica
• placa viral

• Fishman, William H.; Bernfeld, Peter (1955). [ 31 ] Glucuronidasas . Methods in Enzymology. Vol.  1. pp. 262 –9. doi : 10.1016/0076-6879(55)01035-5 .