Tecnología de sonda de ciclismo

La tecnología de sonda cíclica (CPT) es una técnica de biología molecular para detectar secuencias de ADN específicas . La CPT opera en condiciones isotérmicas . En algunas aplicaciones, la CPT ofrece una alternativa a la PCR . Sin embargo, a diferencia de la PCR, la CPT no genera múltiples copias del ADN diana, y la amplificación de la señal es lineal, en contraste con la amplificación exponencial del ADN diana en la PCR. La CPT utiliza una sonda quimérica específica de secuencia que se hibrida con una secuencia de ADN diana complementaria y se convierte en sustrato para la RNasa H. La escisión ocurre en los enlaces internucleotídicos del ARN y da como resultado la disociación de la sonda de la diana, dejándola disponible para la siguiente molécula de sonda. ^{[ 1 ]} Se han desarrollado sistemas electrocinéticos integrados para su uso en CPT. ^{[ 2 ]}

La tecnología de sondas cíclicas utiliza una sonda de ácido nucleico quimérica para detectar la presencia de una secuencia de ADN específica . La sonda quimérica consta de un segmento de ARN intercalado entre dos segmentos de ADN. El segmento de ARN contiene cuatro nucleótidos de purina contiguos . Las sondas deben tener menos de 30 nucleótidos de longitud y estar diseñadas para minimizar las interacciones intra e inter-sonda. ^{[ 3 ]}

La tecnología de sonda cíclica utiliza un proceso isotérmico cíclico que comienza con la hibridación de la sonda quimérica con el ADN diana. Una vez hibridada, la sonda se convierte en un sustrato adecuado para la RNasa H. La RNasa H, una endonucleasa , escinde la porción de ARN de la sonda, lo que da como resultado dos fragmentos quiméricos. La temperatura de fusión (Tm ₎ de los fragmentos recién escindidos es menor que la temperatura de fusión de la sonda original. Debido a que la reacción CPT se mantiene isotérmicamente justo por encima del punto de fusión de la sonda original, los fragmentos escindidos se disocian del ADN diana. Una vez disociado, el ADN diana queda libre para hibridar con una nueva sonda, comenzando el ciclo de nuevo. ^{[ 3 ] [ 4 ]}

Una vez que los fragmentos se han escindido y disociado, se vuelven detectables. Una estrategia común para detectar los fragmentos implica la fluorescencia . Con este método, se une un marcador fluorescente al extremo 5' de la sonda y un extintor al extremo 3' de la misma. ^{[ 4 ] [ 5 ]} Cuando la RNasa H escinde la sonda, el extintor y el marcador fluorescente se separan, aumentando la intensidad del marcador fluorescente. Los fragmentos escindidos también pueden detectarse mediante amplificación (por ejemplo, PCR ) o mediante modificaciones adicionales que permitan otros métodos químicos de detección. ^{[ 6 ]}

Cuando se trabaja con bajas concentraciones de ADN diana, el protocolo CPT puede modificarse para aumentar la especificidad y la eficiencia. Se ha demostrado que aumentar el tiempo asignado mejora la eficiencia de la escisión de la sonda. ^{[ 4 ]} Tanto el aumento de las concentraciones de RNasa H como el uso de una sonda que no sea propensa a interacciones entre sondas e intra-sonda han demostrado aumentar la especificidad. ^{[ 3 ]}

Debido a que la tecnología de sonda cíclica no implica la amplificación del ADN objetivo, la CPT tiene un menor riesgo de contaminación cruzada que la PCR. ^{[ 3 ] [ 4 ]} Además, la CPT es más rápida que la PCR ^{[ 4 ]} y no requiere un termociclador especializado . La CPT tampoco requiere el análisis de los productos de CPT en un gel .

La CPT requiere sondas quiméricas especializadas, lo que hace que los ensayos de CPT sean más costosos que la PCR. ^{[ 5 ]} Debido a la alta especificidad de las sondas de CPT, se debe diseñar una nueva sonda para cada ensayo, lo que incrementa aún más el costo. La implementación clínica se ve obstaculizada financieramente, pero también limitada por la posibilidad de que las muestras contengan ARNasas inespecíficas distintas de la ARNasa H. ^{[ 3 ]}

La CPT puede utilizarse para detectar secuencias de ADN específicas y, por extensión, genotipos específicos . Por ejemplo, la CPT puede utilizarse para distinguir los productos transgénicos de los no transgénicos. ^{[ 5 ]} Clínicamente, la CPT puede utilizarse como alternativa al cultivo celular para detectar la resistencia antibacteriana de un patógeno. ^{[ 4 ]}

La CPT, en esencia, detecta la presencia de una secuencia específica en una muestra. Sin embargo, debido a que las sondas escindidas se acumulan siguiendo una cinética lineal , se puede cuantificar la cantidad de ADN diana. Por consiguiente, la CPT se ha utilizado para cuantificar el número de repeticiones no codificantes en organismos. ^{[ 3 ]}

CPT se puede utilizar junto con otras tecnologías, como sondas moleculares y qPCR . ^{[ 7 ]}