Optimización de la reacción en cadena de la polimerasa

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una herramienta de biología molecular de uso común para amplificar el ADN, y los biólogos moleculares han desarrollado diversas técnicas para la optimización de la PCR con el fin de mejorar su rendimiento y minimizar los fallos.

El método PCR es extremadamente sensible, requiriendo solo unas pocas moléculas de ADN en una sola reacción para amplificar en varios órdenes de magnitud. Por lo tanto, se requieren medidas adecuadas para evitar la contaminación por cualquier ADN presente en el entorno del laboratorio ( bacterias , virus o fuentes humanas). Dado que los productos de amplificaciones de PCR previas son una fuente común de contaminación, muchos laboratorios de biología molecular han implementado procedimientos que implican dividir el laboratorio en áreas separadas. ^{[ 1 ]} Un área del laboratorio se dedica a la preparación y manipulación de reactivos pre-PCR y al montaje de la reacción de PCR, y otra área al procesamiento post-PCR, como la electroforesis en gel o la purificación del producto de PCR. Para el montaje de las reacciones de PCR, muchos procedimientos operativos estándar implican el uso de pipetas con puntas de filtro y el uso de guantes de laboratorio nuevos , y en algunos casos una cabina de flujo laminar con lámpara UV como estación de trabajo (para destruir cualquier formación de neomultímeros extra ). La PCR se evalúa rutinariamente con respecto a una reacción de control negativo que se monta de forma idéntica a la PCR experimental, pero sin ADN molde, y se realiza junto con la PCR experimental.

Las estructuras secundarias del ADN pueden provocar el plegamiento o el anudamiento de la plantilla de ADN o de los cebadores, lo que conlleva una disminución del rendimiento del producto o el fallo de la reacción. Las horquillas , que consisten en pliegues internos causados ​​por el apareamiento de bases entre nucleótidos en repeticiones invertidas dentro del ADN monocatenario, son estructuras secundarias comunes y pueden provocar fallos en las PCR.

Por lo general, el diseño de cebadores que incluye una verificación de posibles estructuras secundarias en los cebadores, o la adición de DMSO o glicerol a la PCR para minimizar las estructuras secundarias en la plantilla de ADN, ^{[ 2 ]} se utilizan en la optimización de PCR que tienen un historial de fallas debido a sospechas de horquillas de ADN.

La polimerasa Taq carece de actividad exonucleasa 3′ a 5′ . Por lo tanto, Taq no tiene actividad de corrección de errores , que consiste en la escisión de cualquier base nucleotídica recién incorporada erróneamente de la cadena de ADN naciente (es decir, en extensión) que no coincida con su base opuesta en la cadena de ADN complementaria. La falta de corrección de errores 3′ a 5′ de la enzima Taq resulta en una alta tasa de error (mutaciones por nucleótido por ciclo) de aproximadamente 1 en 10 000 bases, lo que afecta la fidelidad de la PCR, especialmente si los errores ocurren al principio de la PCR con bajas cantidades de material de partida, causando la acumulación de una gran proporción de ADN amplificado con secuencia incorrecta en el producto final. ^{[ 3 ]}

Se han desarrollado varias ADN polimerasas termoestables de "alta fidelidad" , con actividad exonucleasa 3′ a 5′ modificada genéticamente, que permiten una amplificación más precisa para su uso en PCR para la secuenciación o clonación de productos. Ejemplos de polimerasas con actividad exonucleasa 3′ a 5′ incluyen: la ADN polimerasa KOD, una forma recombinante de Thermococcus kodakaraensis KOD1; Vent, que se extrae de Thermococcus litoralis ; la ADN polimerasa Pfu , que se extrae de Pyrococcus furiosus ; Pwo, que se extrae de Pyrococcus woesii ; ^{[ 4 ]} la polimerasa Q5, con una amplificación de fidelidad 280 veces mayor en comparación con Taq . ^{[ 5 ]}

El magnesio es necesario como cofactor para la ADN polimerasa termoestable. La polimerasa Taq es una enzima dependiente de magnesio y determinar la concentración óptima a utilizar es fundamental para el éxito de la reacción de PCR. ^{[ 6 ]} Algunos componentes de la mezcla de reacción, como la concentración de la plantilla, los dNTP y la presencia de agentes quelantes ( EDTA ) o proteínas, pueden reducir la cantidad de magnesio libre presente, disminuyendo así la actividad de la enzima. ^{[ 7 ]} Los cebadores que se unen a sitios incorrectos de la plantilla se estabilizan en presencia de concentraciones excesivas de magnesio, lo que resulta en una menor especificidad de la reacción. Las concentraciones excesivas de magnesio también estabilizan el ADN de doble cadena e impiden la desnaturalización completa del ADN durante la PCR, reduciendo el rendimiento del producto. ^{[ 6 ] [ 7 ]} Una descongelación inadecuada del MgCl ₂ puede dar lugar a la formación de gradientes de concentración dentro de la solución de cloruro de magnesio suministrada con la ADN polimerasa y también contribuye a muchos experimentos fallidos. ^{[ 7 ]}

La PCR funciona fácilmente con una plantilla de ADN de hasta dos o tres mil pares de bases. Sin embargo, por encima de este tamaño, el rendimiento del producto suele disminuir, ya que con el aumento de la longitud, los efectos estocásticos, como la terminación prematura por la polimerasa, comienzan a afectar la eficiencia de la PCR. Es posible amplificar fragmentos más grandes, de hasta 50 000 pares de bases, con un ciclo de calentamiento más lento y polimerasas especiales. Estas son polimerasas fusionadas a una proteína de unión al ADN que mejora la procesividad, lo que aumenta la adhesión de la polimerasa al ADN. ^{[ 8 ] [ 9 ]}

Otras propiedades valiosas de las polimerasas quiméricas TopoTaq y PfuC2 incluyen una mayor termoestabilidad, especificidad y resistencia a contaminantes e inhibidores . ^{[ 10 ] [ 11 ]} Fueron diseñadas utilizando los dominios únicos de unión al ADN hélice-horquilla-hélice (HhH) de la topoisomerasa V ^{[ 12 ]} del hipertermófilo Methanopyrus kandleri . Las polimerasas quiméricas superan muchas limitaciones de las enzimas nativas y se utilizan en la amplificación directa por PCR a partir de cultivos celulares e incluso muestras de alimentos , evitando así los laboriosos pasos de aislamiento de ADN. Una robusta actividad de desplazamiento de cadena de la polimerasa híbrida TopoTaq ayuda a resolver problemas de PCR que pueden ser causados ​​por horquillas y dobles hélices cargadas de G. Las hélices con un alto contenido de GC poseen una temperatura de fusión más alta, lo que a menudo perjudica la PCR, dependiendo de las condiciones. ^{[ 13 ]}

La unión inespecífica de los cebadores ocurre con frecuencia y puede deberse a varias razones. Estas incluyen secuencias repetidas en la plantilla de ADN, unión inespecífica entre el cebador y la plantilla, alto o bajo contenido de GC en la plantilla o unión incompleta del cebador, dejando el extremo 5' del cebador sin unir a la plantilla. La unión inespecífica de cebadores degenerados también es común. La manipulación de la temperatura de hibridación y la concentración de iones de magnesio puede utilizarse para aumentar la especificidad. Por ejemplo, concentraciones más bajas de magnesio u otros cationes pueden prevenir las interacciones inespecíficas de los cebadores, lo que permite una PCR exitosa. Una enzima polimerasa de "arranque en caliente", cuya actividad se bloquea a menos que se caliente a alta temperatura (p. ej., 90–98 °C) durante la etapa de desnaturalización del primer ciclo, se utiliza comúnmente para prevenir el cebado inespecífico durante la preparación de la reacción a temperaturas más bajas. Las PCR de arranque en caliente mediadas químicamente requieren temperaturas más altas y tiempos de incubación más prolongados para la activación de la polimerasa, en comparación con las PCR de arranque en caliente basadas en anticuerpos o aptámeros.

Otros métodos para aumentar la especificidad incluyen la PCR anidada y la PCR con temperatura de hibridación descendente (Touchdown PCR) .

Se pueden realizar simulaciones por computadora de resultados teóricos de PCR ( PCR electrónica ) para ayudar en el diseño de cebadores. ^{[ 14 ]}

La reacción en cadena de la polimerasa de tipo touchdown, o PCR de tipo touchdown, es un método de PCR en el que los cebadores evitan la amplificación de secuencias inespecíficas. La temperatura de hibridación durante la PCR determina la especificidad de la unión de los cebadores. El punto de fusión del cebador establece el límite superior de la temperatura de hibridación. A temperaturas ligeramente inferiores a este punto, solo se produce un apareamiento de bases muy específico entre el cebador y la plantilla. A temperaturas más bajas, los cebadores se unen con menor especificidad. La unión inespecífica de los cebadores enmascara los resultados de la PCR, ya que las secuencias inespecíficas a las que se unen los cebadores en las primeras etapas de la amplificación "enmascaran" cualquier secuencia específica debido a la naturaleza exponencial de la amplificación de la polimerasa.

Las primeras etapas de un ciclo de reacción en cadena de la polimerasa con temperatura de hibridación descendente (touchdown chain reaction) se realizan a temperaturas de hibridación elevadas. Esta temperatura se reduce gradualmente en cada ciclo posterior (el experimentador elige el número de ciclos y los incrementos de reducción de temperatura). El cebador se hibridará a la temperatura más alta que permita la menor unión inespecífica posible. Por lo tanto, la primera secuencia amplificada es la que se encuentra entre las regiones de mayor especificidad del cebador; es muy probable que esta sea la secuencia de interés. Estos fragmentos se amplificarán posteriormente en rondas más bajas, compitiendo con las secuencias inespecíficas a las que los cebadores podrían unirse a dichas temperaturas. Si el cebador se une inicialmente (durante las fases de alta temperatura) a la secuencia de interés, se pueden realizar rondas posteriores de reacción en cadena de la polimerasa sobre el producto para amplificar aún más esos fragmentos.

La hibridación del extremo 3' de un cebador consigo mismo o con el segundo cebador puede provocar la extensión del cebador, dando lugar a la formación de los denominados dímeros de cebadores, visibles como bandas de bajo peso molecular en los geles de PCR . ^{[ 15 ]} La formación de dímeros de cebadores suele competir con la formación del fragmento de ADN de interés y puede evitarse utilizando cebadores diseñados de forma que carezcan de complementariedad —especialmente en los extremos 3'— consigo mismos o con el otro cebador utilizado en la reacción. Si el diseño del cebador está condicionado por otros factores y se producen dímeros de cebadores, los métodos para limitar su formación pueden incluir la optimización de la concentración de MgCl₂ _o el aumento de la temperatura de hibridación en la PCR. ^{[ 15 ]}

Los desoxinucleótidos (dNTP) pueden unirse a los iones Mg²⁺ ^y , por lo tanto, afectar la concentración de iones de magnesio libres en la reacción. Además, cantidades excesivas de dNTP pueden aumentar la tasa de error de la ADN polimerasa e incluso inhibir la reacción. ^{[ 6 ] [ 7 ]} Un desequilibrio en la proporción de los cuatro dNTP puede resultar en la incorporación errónea a la cadena de ADN recién formada y contribuir a una disminución en la fidelidad de la ADN polimerasa. ^{[ 16 ]}