Persecución de cicloheximida

Los ensayos de persecución con cicloheximida son una técnica experimental utilizada en biología molecular y celular para medir la estabilidad de las proteínas en estado estacionario. La cicloheximida es un fármaco que inhibe el paso de elongación en la traducción de proteínas eucariotas , lo que impide la síntesis de proteínas. ^[1] La adición de cicloheximida a células cultivadas seguida de la lisis de proteínas en múltiples puntos temporales se lleva a cabo para observar la degradación de proteínas a lo largo del tiempo y se puede utilizar para determinar la vida media de una proteína. Estos ensayos suelen ir seguidos de transferencia Western para evaluar la abundancia de proteínas y se pueden analizar utilizando herramientas cuantitativas como ImageJ. ^[2]

Implementación

Los ensayos de persecución con cicloheximida se han llevado a cabo utilizando una variedad de tipos de células, como líneas celulares de levadura y mamíferos. ^{[3] [4] [5] [6]} Dependiendo del sistema celular utilizado para el análisis, el ensayo puede variar en la aplicación y el transcurso del tiempo. Por ejemplo, las células de levadura que expresan un sustrato proteico de interés suelen requerir persecuciones con cicloheximida que duran hasta 90 minutos para permitir que se produzca la renovación de proteínas. ^{[4] [7]} Por el contrario, las proteínas que se expresan en líneas celulares de mamíferos tienden a ser más estables en estado estacionario y pueden requerir una persecución que dure de 3 a 8 horas. ^{[4] [5] [6]} Dependiendo de la complejidad de la proteína y de si está sobreexpresada o es endógena al sistema modelo, la duración requerida de la persecución puede variar. Para garantizar que la síntesis de proteínas se inhiba durante toda la persecución, a menudo se añade cicloheximida a la muestra cada pocas horas.

En levaduras , las cepas de deleción se utilizan frecuentemente para evaluar la estabilidad de las proteínas a lo largo del tiempo con persecuciones de cicloheximida. Por ejemplo, las cepas de levadura que carecen de maquinaria de degradación crítica, como chaperonas, ligasas E3 y proteínas vacuolares, se utilizan a menudo para determinar el mecanismo de degradación de un sustrato proteico de interés. ^{[5] [7]} Los tratamientos farmacológicos (como MG132 ) también se utilizan para inhibir los pasos de degradación, seguidos de una persecución de cicloheximida para observar cómo se afecta la estabilidad de una proteína de interés. ^{[3] [4] [7]} Estos experimentos se pueden realizar en células de mamíferos con la implementación de procedimientos de eliminación compatibles en lugar de las cepas de deleción de levaduras. ^[4]

Las secuencias de cicloheximida también son valiosas para evaluar cómo las diferentes mutaciones afectan la estabilidad de una proteína. Se han realizado experimentos en células de levadura y de mamíferos para determinar los residuos críticos necesarios para la estabilidad de las proteínas y cómo las mutaciones asociadas a enfermedades pueden afectar las vidas medias de las proteínas dentro de la célula. ^{[3] [6]} Esta información es valiosa para comprender las complejidades del plegamiento de las proteínas y cómo las mutaciones contribuyen a la patogénesis de las enfermedades con las que están asociadas.

Ventajas

Existen muchos beneficios en el uso de ensayos de persecución con cicloheximida en comparación con otros métodos que evalúan la estabilidad de las proteínas. Las persecuciones con cicloheximida se pueden utilizar con una amplia variedad de sistemas modelo y se pueden implementar para estudiar casi cualquier sustrato proteico. La cicloheximida es un compuesto relativamente económico en comparación con otros fármacos y es eficaz cuando se utiliza en dosis bajas durante períodos cortos de tiempo. Los ensayos de persecución por pulsos son un método alternativo a los ensayos de persecución con cicloheximida e implican el marcado radiactivo de las proteínas recién traducidas seguido de un período de "persecución" similar. ^[8] Si bien este método es informativo y proporciona el beneficio de observar la abundancia de proteínas nacientes, el material radiactivo que requiere es caro, tiene una vida útil más corta y exige más precaución al usarlo que la cicloheximida.

Desventajas

Algunas desventajas de realizar ensayos de persecución con cicloheximida incluyen la naturaleza tóxica de la cicloheximida. Cuando se utiliza en altas concentraciones durante un largo período de tiempo, la cicloheximida dañará el ADN dentro de la célula y perjudicará la función celular crítica. ^[9] Por esta razón, las persecuciones con cicloheximida normalmente no duran más de 12 horas. Esto presenta una limitación si se está estudiando el recambio de una proteína particularmente estable. Además, las persecuciones con cicloheximida solo ofrecen la capacidad de observar los niveles de proteínas en estado estable en lugar de los niveles de proteínas recién traducidas, como con la persecución por pulsos. Por lo tanto, solo se puede observar la degradación de proteínas y no la maduración de proteínas.