Ingeniería del citocromo P450

La ingeniería racional de enzimas se caracteriza por realizar mutaciones específicas de aminoácidos basadas en información mecanicista o estructural. Si bien las enzimas P450 se comprenden bien desde el punto de vista mecanicista, las mutaciones basadas en información estructural suelen estar limitadas por la dificultad de cristalización . ^{[ 4 ] [ 5 ]} Aunque, cuando se pueden obtener, el alto grado de flexibilidad y plasticidad del sitio activo presente en las P450 hace que las estructuras cristalinas sean en gran medida obsoletas para el diseño racional. ^{[ 5 ]} Otro problema surge al intentar ampliar el alcance del sustrato. Esto se logra a menudo aumentando el tamaño del sitio activo de la P450 , lo que a su vez puede resultar en múltiples orientaciones de acoplamiento del sustrato , lo que resulta en una regio-/estereoselectividad deficiente. ^{[ 5 ]}

La evolución dirigida es una estrategia de ingeniería enzimática diseñada para imitar la selección natural en un entorno de laboratorio. ^{[ 2 ] [ 4 ] [ 5 ]} Debido a la dificultad de implementar estrategias de diseño racional, la evolución dirigida se ha convertido en la estrategia de elección para la ingeniería de P450. Aquí, las mutaciones se pueden introducir de forma semirracional o aleatoria mediante mutagénesis de saturación de sitio . El mutante P450 resultante (típicamente una biblioteca de mutantes) se examina para detectar la actividad deseada. ^{[ 5 ] [ 6 ] [ 7 ]} Los mutantes que muestran propiedades mejoradas se envían a rondas posteriores de mutagénesis, repitiendo este ciclo hasta que se cumpla adecuadamente la función deseada.

P450 BM3 (también conocido como CYP102A1) es una enzima citocromo P450 aislada de Bacillus megaterium . ^{[ 2 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] [ 8 ]} BM3 ha sido ampliamente estudiado en el contexto de la ingeniería enzimática debido a su solubilidad, isoformas bacterianas manejables y sistema de transporte de electrones autosuficiente, pero también debido a su utilidad sintética. ^{[ 8 ]} Los estudios de ingeniería han revelado que los mutantes de BM3 pueden 1) ser dotados de nuevos y diferenciados alcances de sustrato 2) exhibir regio-/estereoselectividad en nuevos sustratos y 3) ser diseñados para ser altamente selectivos y activos hacia nuevos sustratos. ^{[ 5 ] [ 6 ] [ 8 ]} Las variantes de BM3 han sido particularmente útiles para producir fragancias , sabores , feromonas y productos farmacéuticos . ^{[ 8 ]} El ácido artemisínico (utilizado en la producción del producto farmacéutico natural artemisinina ) se produjo utilizando una variante de BM3 responsable de la epoxidación de los dos alquenos presentes en el amorfa-4,11-dieno. ^{[ 8 ] [ 9 ]} La oxidación del valenceno a nootkatona (un apreciado sabor a pomelo) se logró utilizando un mutante F87T e I263A (Figura 1). ^{[ 8 ]}

Recientemente, Wang et al. informaron una variante de BM3 capaz de realizar la ciclopropanación de olefinas estirenílicas . ^{[ 6 ]} Como la BM3 nativa muestra una actividad de ciclopropanación baja, se emprendió un esfuerzo de ingeniería enzimática. En su núcleo, las P450 son enzimas hemo-tiolato que utilizan oxígeno molecular (O ₂ ) y NAD(P)H para realizar reacciones de oxigenación. ^{[ 10 ]} Por lo tanto, BM3 prefiere realizar reacciones de epoxidación en lugar de ciclopropanación en presencia de olefinas. ^{[ 6 ]} La reacción entre el diazoacetato de etilo (EDA) y 1 se eligió como reacción modelo debido a la conocida dificultad de epoxidar olefinas deficientes en electrones utilizando catálisis de metales de transición (Figura 2). ^{[ 6 ]} Esta reacción genera el compuesto 2 , que puede convertirse fácilmente en levomilnaciprán (Fetzima), un fármaco utilizado para tratar la depresión clínica . ^{[ 6 ]} Para empezar, se generaron mutantes donde el residuo de cisteína coordinador axial en el centro catalítico fue reemplazado por los aminoácidos serina, alanina, metionina, histidina y tirosina. El mutante T268A-axH, que tiene un ligando de histidina axial, catalizó la reacción entre EDA y 1 en un rendimiento del 81% con una diastereoselectividad de 6:94 y una enantioselectividad del 42%. ^{[ 6 ]} Luego se realizaron rondas posteriores de mutagénesis de saturación de sitio , lo que dio como resultado la variante denominada BM3-Hstar (que contiene las mutaciones T268A-axH, L437W, V78M y L181V), que pudo catalizar la reacción modelo con un rendimiento superior al 92%, una enantioselectividad del 92% y una diastereoselectividad de 2:98. ^{[ 6 ]} Como ventaja adicional, BM3-Hstar también fue capaz de realizar la reacción de ciclopropanación deseada en presencia de oxígeno atmosférico (O2) (la única variante conocida de BM3 capaz de esto). ^{[ 6 ]}

Además de su utilidad sintética, las enzimas P450 también se han diseñado para comprender mejor su bioquímica. ^{[ 10 ]} Según el ciclo catalítico propuesto, una fracción tiolato ligada axialmente (cisteína) dona densidad electrónica al centro metálico, lo que ayuda en la protonación de un intermedio de anión peroxo férrico ( ⁻ OO-Fe ³⁺ ) que, tras la pérdida de agua, genera una especie de hierro-oxo reactiva con enlace CH (O=Fe ⁴⁺ ). ^{[ 2 ] [ 5 ] [ 8 ] [ 10 ]} Alternativamente, si el anión peroxo férrico permanece sin protonar, esta especie reactiva puede mediar la ruptura del enlace CC en sustratos que contienen aldehído (desformilación). ^{[ 10 ]} Para comprender mejor la dicotomía intermedia entre el anión peroxo férrico y las especies oxo de hierro, se modificó la enzima CYP125 (responsable de diversos procesos metabólicos, incluida la degradación del colesterol) para reemplazar el residuo de cisteína ligado axialmente con selenocisteína (SeCYP125). A su vez, se observó que SeCYP125 favorece la formación de productos oxidados frente a productos desformilados cuando reacciona con colesterol-26-aldehído, lo que indica que una mayor donación de electrones de la selenocisteína en relación con la cisteína resulta en una mayor proporción de oxo de hierro en relación con el anión peroxo férrico (Figura 3). ^{[ 10 ]}

En 2016, un trabajo publicado por Dydio et al. informó sobre una metaloenzima artificial capaz de catalizar inserciones intra/intermoleculares de carbenos CH en enlaces CH activados/no activados, con una cinética similar a la de una enzima nativa (Figura 4). El catalizador descrito se desarrolló mediante la sustitución del cofactor hierro-protoporfirina en la enzima termoestable P450 CYP119A1 por un cofactor iridio-metil- protoporfirina (Ir(Me)-PIX), seguido de evolución dirigida. Posteriormente se obtuvo CYP119-Max, un mutante cuádruple (C317G, T213G, L69V, V254L). Se obtuvieron excesos enantioméricos (ee) de hasta ±98% con una carga de catalizador fija de 0,17  mol  %. CYP119-Max también puede experimentar reacciones de inserción intermolecular, aunque con un ee moderado (68%). Para demostrar la aplicabilidad de CYP119-Max en la producción de productos químicos finos, una reacción a escala de 200 mM produjo etil-2,3-dihidrobenzofurano-3-carboxilato con un rendimiento del 44%, un número de recambio (TON) de 35.000 y un 93% de ee. ^{[ 7 ]}