DARPin

Las DARPins ( acrónimo de proteínas de repetición de anquirina diseñadas ) son proteínas miméticas de anticuerpos modificadas genéticamente que suelen presentar una unión a proteínas diana altamente específica y de alta afinidad . Se derivan de proteínas de repetición de anquirina naturales , una de las clases más comunes de proteínas de unión en la naturaleza, responsables de diversas funciones como la señalización celular, la regulación y la integridad estructural de la célula. Las DARPins constan de al menos tres motivos o módulos de repetición, de los cuales los módulos más N-terminal y más C-terminal se denominan "tapas", ya que protegen el núcleo hidrofóbico de la proteína. El número de módulos internos se indica con un número (por ejemplo, N1C, N2C, N3C, ...) mientras que las tapas se indican con "N" o "C", respectivamente. La masa molecular de, por ejemplo, 14 o 18 kDa ( kilodaltons ) para las DARPins de cuatro (N2C) o cinco (N3C) repeticiones es bastante pequeña para un producto biológico (aproximadamente el 10 % del tamaño de una IgG ).

Las DARPins constituyen una nueva clase de fármacos proteicos pequeños, potentes, específicos y versátiles, y se utilizan como herramientas de investigación en diversas aplicaciones de investigación, diagnóstico y terapéuticas . ^{[ 1 ]} Molecular Partners AG , una compañía biofarmacéutica en fase clínica con varias moléculas DARPin en desarrollo clínico y preclínico, actualmente desarrolla DARPins terapéuticos tanto por su cuenta como en colaboración con socios. Athebio AG se basa en la mejora continua del andamiaje DARPin para un modelo de colaboración . ^{[ 2 ]}

Además, las DARPins pueden utilizarse como chaperonas de cristalización para proteínas solubles y de membrana, incluidos los receptores acoplados a proteínas G (GPCR), ya sea como socios de unión o como fusiones rígidas a la proteína diana, un concepto que ahora se está extendiendo a la determinación de la estructura mediante crio-EM. ^{[ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]}

La plataforma DARPin fue descubierta y desarrollada en el laboratorio de Andreas Plückthun en la Universidad de Zúrich , Suiza , mientras estudiaba ingeniería y bibliotecas de anticuerpos recombinantes. ^{[ 7 ]} Los DARPins se derivan de proteínas anquirinas presentes de forma natural, una clase de proteínas que median interacciones proteína-proteína de alta afinidad en la naturaleza.

Las bibliotecas DARPin se diseñaron mediante alineaciones de secuencias de varios miles de motivos de repetición de anquirina naturales (de aproximadamente 33 aminoácidos cada uno) combinados con diseño basado en la estructura y métodos de ADN recombinante . ^{[ 7 ]} Estas proteínas consisten en unidades estructurales repetitivas que forman un dominio proteico estable con una gran superficie potencial de interacción con el objetivo. Típicamente, los DARPin comprenden cuatro o cinco repeticiones, de las cuales la primera (repetición de tapa N) y la última (repetición de tapa C) sirven para proteger el núcleo proteico hidrofóbico del entorno acuoso. Los DARPin corresponden al tamaño promedio de los dominios proteicos de repetición de anquirina naturales. Las proteínas con menos de tres repeticiones (es decir, las repeticiones de tapa y una repetición interna) no forman una estructura terciaria suficientemente estable. ^{[ 8 ]} La masa molecular de un DARPin depende del número total de repeticiones, como se muestra en el siguiente gráfico:

Se han generado bibliotecas de DARPins con residuos de interacción con el objetivo potencial aleatorios a nivel de ADN. A partir de estas bibliotecas, los bioquímicos pueden seleccionar DARPins para unirse al objetivo deseado con afinidad picomolar y la especificidad se puede seleccionar usando la visualización en ribosomas ^{[ 9 ]} o la visualización en fagos ^{[ 10 ]} usando secuencias señal que permiten la secreción cotraduccional. ^{[ 11 ]} Los DARPins se pueden diseñar para actuar como agonistas de receptores , antagonistas , agonistas inversos , inhibidores de enzimas o simples ligandos de proteínas objetivo. ^{[ 1 ]}

DARPins are expressed in the cytoplasm of Escherichia coli at high levels (over 10 g/L in fermentation, 1 g/L in shake flask) in soluble form.^[12] The proteins exhibit high thermal and thermodynamic stability (denaturation midpoint: usually equilibrium unfolding: ∆G > 9.5 kcal/mol) increasing with increasing repeat number.^[7][13][14] DARPins are stable in human blood serum and can be engineered so as not to contain T-cellepitopes.

Due to the high specificity, stability, potency and affinity, as well as their flexible architecture, DARPins have a rigid body-binding mode.^[1][9] Multi-specific or multivalent constructs made by genetic fusion suggest that fused DARPins have similar binding properties as single-domain DARPins.^[1] The absence of cysteines in the scaffold enables engineering of site-specific cysteines, allowing site-directed coupling of chemicals to the molecule. Non-natural amino acids can be introduced for the same purpose.^[15]

Potentially, DARPins can provide clinical benefit by overcoming the limitations of conventional therapeutic approaches, which typically target a single disease pathway and thus may compromise efficacy. In many cases, the complexity of a disease results from the dysregulation of multiple pathways. DARPin technology can be leveraged to rapidly generate thousands of different "multi-DARPins" where the binding domains are connected (i.e., by linkers), thereby enabling the targeting of several disease pathways. DARPins and multi-DARPins can also be fused to non-DARPin elements, such as a toxin,^[16] to generate targeted therapeutics, and their manufacture is facilitated by the resistance of DARPins against aggregation. The diversity of formats and robustness of multi-DARPins facilitates an empirical approach (such as through outcome-based screening) to efficiently identify DARPins with potential activity in specific disease pathways.

Los beneficios potenciales de los DARPins se deben en gran medida a sus características estructurales y biofísicas. Se cree que su pequeño tamaño (14-18 kDa) permite una mayor penetración en los tejidos, y su alta potencia (<5-100 pM) hace que los DARPins sean activos a bajas concentraciones. ^{[ 17 ]} Los DARPins son solubles a >100 g/L, y su alta estabilidad y solubilidad se consideran propiedades deseables para los compuestos farmacéuticos. Los DARPins se pueden producir de forma rápida y rentable (es decir, a partir de E. coli ). Sus propiedades farmacocinéticas (PK) se pueden ajustar mediante la fusión con moléculas que prolongan la vida media, como el polietilenglicol (PEG), o mediante la unión de los DARPins a la albúmina sérica humana. Debido a sus favorables propiedades biofísicas, ^{[ 1 ]} los DARPins se consideran altamente desarrollables utilizando procesos estándar, lo que potencialmente exhibe un comportamiento de clase robusto.

Los DARPins se han utilizado como herramientas de investigación, ^{[ 1 ]} como agentes de diagnóstico ^{[ 17 ]} y como agentes terapéuticos. ^{[ 18 ] [ 19 ] [ 20 ] [ 21 ]} MP0112, el primer candidato DARPin en la clínica, es un inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y entró en ensayos clínicos para el tratamiento de la degeneración macular húmeda relacionada con la edad (DMAE húmeda, también conocida como degeneración macular neovascular relacionada con la edad) ^{[ 16 ]} y el edema macular diabético ^{[ 22 ]} a principios de 2010.

Actualmente, MP0112 se está investigando en tres ensayos clínicos diferentes. Los dos primeros ensayos son estudios de seguridad y eficacia de abicipar en pacientes con DMAE húmeda para establecer la comparabilidad entre pacientes japoneses y no japoneses. ^{[ 18 ] [ 20 ]} El tercer estudio es para probar la seguridad y la eficacia de abicipar en pacientes con EMD. ^{[ 19 ]}

En julio de 2014, Molecular Partners inició un estudio en humanos para investigar la seguridad, la tolerabilidad y los niveles sanguíneos de MP0250, un segundo candidato a DARPin, en pacientes con cáncer. ^{[ 21 ]}

Molecular Partners AG tiene varios DARPins adicionales en desarrollo preclínico con posibles indicaciones en diversas áreas de enfermedades, incluidas la oftalmología , la oncología , la inmuno-oncología y la inmunología .