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Electroforesis en gel con gradiente de temperatura

Imagen negativa de un gel DGGE teñido con bromuro de etidio. La electroforesis en gel con gradiente de temperatura ( TGGE ) y la electroforesis en gel con gradiente desnaturaliz...

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Imagen negativa de un gel DGGE teñido con bromuro de etidio.

La electroforesis en gel con gradiente de temperatura ( TGGE ) y la electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante ( DGGE ) son formas de electroforesis que utilizan un gradiente de temperatura o químico para desnaturalizar la muestra a medida que se mueve a través de un gel de acrilamida . Tanto la TGGE como la DGGE se pueden aplicar a ácidos nucleicos como el ADN y el ARN , y (con menos frecuencia) a proteínas. La TGGE se basa en cambios estructurales dependientes de la temperatura para separar los ácidos nucleicos . La DGGE separa genes del mismo tamaño en función de su diferente capacidad de desnaturalización, que está determinada por su secuencia de pares de bases. La DGGE fue la técnica original, y la TGGE un perfeccionamiento de la misma.

Historia

El DGGE fue inventado por Leonard Lerman , mientras era profesor en SUNY Albany. [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]

El mismo equipo puede utilizarse para el análisis de proteínas , lo cual fue realizado por primera vez por Thomas E. Creighton del Laboratorio de Biología Molecular del MRC , Cambridge, Inglaterra. [ 4 ] Las proteínas y los ácidos nucleicos producen patrones de aspecto similar, pero los principios fundamentales son bastante diferentes.

La TGGE fue descrita por primera vez por Thatcher y Hodson [ 5 ] y por Roger Wartell del Instituto Tecnológico de Georgia. El grupo de Riesner en Alemania realizó un extenso trabajo al respecto. Existen equipos comerciales para DGGE disponibles de Bio-Rad, INGENY y CBS Scientific; Biometra ofrece un sistema para TGGE.

Electroforesis en gel con gradiente de temperatura

El ADN tiene carga negativa, por lo que se desplaza hacia el electrodo positivo en presencia de un campo eléctrico. Un gel es una malla molecular con poros de un tamaño similar al diámetro de la cadena de ADN. Al aplicar un campo eléctrico, el ADN comienza a moverse a través del gel a una velocidad aproximadamente inversamente proporcional a su longitud (las cadenas más cortas se desplazan más rápido); este es el principio de separación por tamaño en la electroforesis estándar.

En TGGE también existe un gradiente de temperatura a través del gel. A temperatura ambiente, el ADN existirá de forma estable en forma de doble cadena. A medida que aumenta la temperatura, las cadenas comienzan a separarse ( fusión ) y la velocidad a la que se mueven a través del gel disminuye drásticamente. Es fundamental destacar que la temperatura a la que ocurre la fusión depende de la secuencia (los pares de bases GC son más estables que los AT debido a las interacciones de apilamiento, no debido a la diferencia en los enlaces de hidrógeno (hay tres enlaces de hidrógeno entre un par de bases de citosina y guanina , pero solo dos entre adenina y timina ), por lo que TGGE proporciona un "método dependiente de la secuencia e independiente del tamaño" para separar moléculas de ADN. TGGE separa las moléculas y proporciona información adicional sobre el comportamiento de fusión y la estabilidad. [ 6 ]

Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante

La electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) funciona aplicando una pequeña muestra de ADN (o ARN) a un gel de electroforesis que contiene un agente desnaturalizante . Los investigadores han descubierto que ciertos geles desnaturalizantes son capaces de inducir la fusión del ADN en distintas etapas. Como resultado de esta fusión, el ADN se dispersa a través del gel y puede analizarse para detectar componentes individuales, incluso aquellos tan pequeños como de 200 a 700 pares de bases .

Lo que hace única a la técnica DGGE es que, a medida que el ADN se somete a condiciones desnaturalizantes cada vez más extremas, las hebras fundidas se fragmentan completamente en hebras simples. El proceso de desnaturalización en un gel desnaturalizante es muy abrupto: "En lugar de fundirse parcialmente de forma continua como una cremallera, la mayoría de los fragmentos se funden en un proceso gradual. Porciones o dominios discretos del fragmento se convierten repentinamente en hebras simples dentro de un rango muy estrecho de condiciones desnaturalizantes" (Helms, 1990). [ 7 ] Esto permite discernir diferencias en las secuencias de ADN o mutaciones de varios genes: las diferencias de secuencia en fragmentos de la misma longitud a menudo hacen que se fundan parcialmente en diferentes posiciones del gradiente y, por lo tanto, se "detengan" en diferentes posiciones del gel. Al comparar el comportamiento de fusión de los fragmentos de ADN polimórficos uno al lado del otro en geles de gradiente desnaturalizante, es posible detectar fragmentos que tienen mutaciones en el primer dominio de fusión (Helms, 1990). Debido a que la DGGE estándar no cubre bien el dominio de fusión más alto, los ensayos también pueden agregar una pinza rica en GC a un cebador de PCR para ayudar a prevenir la disociación completa de la cadena y permitir la detección de mutaciones en dominios de fusión más altos del fragmento. [ 8 ] [ 9 ] Al colocar dos muestras una al lado de la otra en el gel y permitir que se desnaturalicen juntas, los investigadores pueden ver fácilmente incluso las diferencias más pequeñas en dos muestras o fragmentos de ADN.

Esta técnica presenta varias desventajas: «Los gradientes químicos, como los utilizados en DGGE, no son tan reproducibles, son difíciles de establecer y, a menudo, no resuelven completamente los heterodúplex » (Westburg, 2001). Estos problemas se solucionan con TGGE, que utiliza un gradiente de temperatura, en lugar de uno químico, para desnaturalizar la muestra.

Método

Para separar ácidos nucleicos mediante TGGE, se deben realizar los siguientes pasos: preparación y vertido de los geles, electroforesis, tinción y elución del ADN. Dado que se debe elegir un sistema tamponado , es importante que el sistema se mantenga estable en el contexto del aumento de la temperatura. Por lo tanto, la urea se utiliza típicamente para la preparación del gel; sin embargo, los investigadores deben tener en cuenta que la cantidad de urea utilizada afectará la temperatura general requerida para separar el ADN. [ 6 ] Se carga el gel, se coloca la muestra en el gel según el tipo de gel que se esté ejecutando (es decir, paralelo o perpendicular), se ajusta el voltaje y se puede dejar correr la muestra. [ 6 ] Dependiendo del tipo de TGGE que se vaya a ejecutar, ya sea perpendicular o paralelo , se deben preparar y cargar diferentes cantidades de muestra. Se utiliza una mayor cantidad de una sola muestra con TGGE perpendicular, mientras que se utiliza una menor cantidad de muchas muestras con TGGE paralelo. Una vez que se ha corrido el gel, se debe teñir para visualizar los resultados. Si bien existen diversas tinciones que pueden utilizarse para este fin, la tinción con plata ha demostrado ser la más eficaz. [ 6 ] El ADN puede eluirse de la tinción con plata para su posterior análisis mediante amplificación por PCR . [ 6 ]

Aplicaciones

Las técnicas TGGE y DGGE son ampliamente útiles en la investigación biomédica y ecológica; a continuación se describen algunas aplicaciones seleccionadas.

Mutaciones en el ADN mitocondrial

Según una investigación reciente de Wong, Liang, Kwon, Bai, Alper y Gropman, [ 10 ] la TGGE puede utilizarse para examinar el ADN mitocondrial de un individuo. Según estos autores, la TGGE se utilizó para determinar dos nuevas mutaciones en el genoma mitocondrial : "Una mujer de 21 años con sospecha de citopatía mitocondrial, pero negativa para mutaciones puntuales y deleciones comunes del ADN mitocondrial (ADNmt), fue examinada para detectar mutaciones desconocidas en todo el genoma mitocondrial mediante electroforesis en gel con gradiente de temperatura". [ 11 ]

Mutación del gen p53 en las secreciones pancreáticas

Lohr y colaboradores (2001) informan que en un estudio exhaustivo de secreciones pancreáticas de individuos sin carcinoma pancreático , se pudieron encontrar mutaciones de p53 en los jugos pancreáticos de un pequeño porcentaje de participantes. [ 12 ] Dado que se han encontrado mutaciones de p53 extensamente en carcinomas pancreáticos, los investigadores de esta investigación intentaron determinar si la mutación en sí misma puede estar relacionada con el desarrollo del cáncer de páncreas. Si bien Lohr pudo encontrar mutaciones de p53 mediante TGGE en algunos sujetos, ninguno desarrolló posteriormente carcinoma pancreático. Por lo tanto, los investigadores concluyen señalando que la mutación de p53 puede no ser el único indicador de la oncogénesis del carcinoma pancreático.

Ecología microbiana

La DGGE de genes que codifican la subunidad ribosómica pequeña fue descrita por primera vez por Gerard Muyzer , [ 13 ] mientras era investigador postdoctoral en la Universidad de Leiden , y se ha convertido en una técnica ampliamente utilizada en ecología microbiana.

La amplificación por PCR del ADN extraído de comunidades microbianas mixtas con cebadores específicos para fragmentos del gen ARNr 16S de bacterias y arqueas , y fragmentos del gen ARNr 18S de eucariotas , produce mezclas de productos de PCR. Dado que estos amplicones tienen la misma longitud, no pueden separarse mediante electroforesis en gel de agarosa. Sin embargo, las variaciones de secuencia (es decir, las diferencias en el contenido y la distribución de GC) entre los distintos ARNr microbianos dan lugar a diferentes propiedades de desnaturalización de estas moléculas de ADN.

Por lo tanto, los patrones de bandas DGGE pueden utilizarse para visualizar variaciones en la diversidad genética microbiana y proporcionar una estimación aproximada de la riqueza o abundancia de los miembros predominantes de la comunidad microbiana. Este método se conoce a menudo como huella genética de la comunidad . Recientemente, varios estudios han demostrado que el DGGE de genes funcionales (por ejemplo, genes implicados en la reducción de azufre, la fijación de nitrógeno y la oxidación de amonio) puede proporcionar información sobre la función y la filogenia microbianas simultáneamente. Por ejemplo, Tabatabaei et al. (2009) aplicaron DGGE y lograron revelar el patrón microbiano durante la fermentación anaeróbica del efluente de la planta de procesamiento de aceite de palma (POME) por primera vez. [ 14 ]

Referencias

  1. ↑ Fischer SG, Lerman LS (enero de 1979). "Separación independiente de la longitud de fragmentos de restricción de ADN en electroforesis bidimensional en gel". Cell . 16 (1): 191–200 . doi : 10.1016/0092-8674(79)90200-9 . PMID 369706 . 
  2. ↑ Fischer SG, Lerman LS (agosto de 1980). "Separación de fragmentos aleatorios de ADN según las propiedades de sus secuencias" . Proc Natl Acad Sci USA . 77 (8): 4420–4 . Bibcode : 1980PNAS...77.4420F . doi : 10.1073/pnas.77.8.4420 . PMC 349855. PMID 6254023 .  
  3. ↑ Fischer SG, Lerman LS (marzo de 1983). "Los fragmentos de ADN que difieren por sustituciones de un solo par de bases se separan en geles de gradiente desnaturalizantes: correspondencia con la teoría de fusión" . Proc Natl Acad Sci USA . 80 (6): 1579–83 . Bibcode : 1983PNAS...80.1579F . doi : 10.1073/pnas.80.6.1579 . PMC 393645. PMID 6220406 .  
  4. ↑ Creighton TE, Shortle D (octubre de 1994). "Caracterización electroforética de los estados desnaturalizados de la nucleasa estafilocócica" . J Mol Biol . 242 (5): 670–82 . doi : 10.1006/jmbi.1994.1616 . PMID 7932723 . 
  5. ↑ Thatcher DR, Hodson B (julio de 1981). "Desnaturalización de proteínas y ácidos nucleicos mediante electroforesis con gradiente térmico" . Biochem J. 197 ( 1): 105–9 . doi : 10.1042/bj1970105 . PMC 1163059. PMID 6797412 .  
  6. ^ " Sistema TGGE MAXI " ( PDF ) . labrepco.com . Biometra biomedizinische Analytik GmbH. 2000 . Consultado el 4 de enero de 2026 .
  7. ↑ Helms, C (1990). "Método: Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)" (PDF) . studylib.net . Consultado el 5 de enero de 2026 .
  8. ↑ Diagnóstico molecular: prevención de talasemias y otros trastornos de la hemoglobina . Biblioteca del NCBI.
  9. ↑ "Mejoras en la composición del gel y las condiciones electroforéticas para el análisis de mutaciones de amplio espectro mediante electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante" . Nucleic Acids Research . Oxford University Press.
  10. ↑ Wong LJ, Yim D, Bai RK, Kwon H, Vacek MM, Zane J, Hoppel CL, Kerr DS (septiembre de 2006). "Una nueva mutación en el gen del ARNt mitocondrial (Ser(AGY)) asociada con miopatía mitocondrial, encefalopatía y deficiencia del complejo I" . J Med Genet . 43 (9): e46. doi : 10.1136/jmg.2005.040626 . PMC 2564579. PMID 16950817 .  
  11. ↑ Wong LJ, Liang MH, Kwon H, Bai RK, Alper O, Gropman A (2002). "Un paciente con fibrosis quística con dos nuevas mutaciones en el ADN mitocondrial: la enfermedad leve provocó un diagnóstico tardío de ambos trastornos". Am. J. Med. Genet. 113 (1): 59– 64. doi : 10.1002/ajmg.10767 . PMID 12400067 . 
  12. ↑ Löhr M, Müller P, Mora J, Brinkmann B, Ostwald C, Farré A, Lluis F, Adam U, Stubbe J, Plath F, Nizze H, Hopt UT, Barten M, Capellá G, Liebe S (2001). "Mutaciones de p53 y K-ras en muestras de jugo pancreático de pacientes con pancreatitis crónica". Endoscopia Gastrointestinal . 53 (7): 734– 743. doi : 10.1067/mge.2001.112711 .
  13. ↑ Muyzer G, de Waal EC, Uitterlinden AG (marzo de 1993). "Perfilado de poblaciones microbianas complejas mediante análisis de electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante de genes amplificados por reacción en cadena de la polimerasa que codifican el ARNr 16S" . Appl Environ Microbiol . 59 (3): 695–700 . Bibcode : 1993ApEnM..59..695M . doi : 10.1128/aem.59.3.695-700.1993 . PMC 202176. PMID 7683183 .  
  14. ↑ Tabatabaei M, Zakaria MR, Rahim RA, Wright AD, Shirai Y, Abdullah N, Sakai K, Ikeno S, Mori M, Kazunori N, Sulaiman A (2009). "Análisis de metanógenos mediante DGGE y FISH basados ​​en PCR en un tanque digestor cerrado anaeróbico para el tratamiento de efluentes de molinos de aceite de palma" (PDF) . Revista electrónica de biotecnología . 12 (3): 12– 13. doi : 10.4067/S0717-34582009000300012 (inactivo el 1 de julio de 2025).{{cite journal}}: CS1 maint: DOI inactivo desde julio de 2025 ( enlace )
  • Charles J. Sailey, MD, MS. Fragmentos extraídos de un documento resumen titulado "TGGE". 2003. Universidad de las Ciencias de Filadelfia.