toma de huellas dactilares comunitarias

Para realizar T-RFLP (Figura 1), se debe seleccionar un gen diana (por ejemplo, el gen del ARNr 16S) para amplificarlo mediante PCR . Al menos un cebador utilizado en la reacción de PCR está marcado con fluorescencia en el extremo 5' . Tras la amplificación por PCR, cada segmento de ADN copiado lleva la etiqueta fluorescente. A continuación, se utilizan enzimas de restricción para cortar el ADN amplificado en sitios de reconocimiento específicos . Se parte de la premisa de que cada microorganismo de la muestra tendrá una secuencia diferente en el gen diana, por lo que una enzima de restricción cortará el ADN de cada microorganismo en un lugar distinto. (Cada sitio de restricción diferente se considera una única unidad taxonómica operativa [OTU]). De este modo, la enzima producirá un fragmento de una longitud diferente para cada tipo de microorganismo presente en la muestra. El resultado de la digestión es un conjunto de fragmentos de restricción de diferentes longitudes, cada uno de los cuales está marcado con fluorescencia en un extremo. Estos se conocen como "fragmentos terminales" porque están marcados en el extremo donde se unió el cebador de PCR. (Los extremos no etiquetados no se registran en el análisis final). A continuación, los fragmentos se separan por tamaño mediante electroforesis en gel o capilar . La detección láser registra el tamaño y los patrones de intensidad de fluorescencia de los fragmentos terminales. Se incluyen en el análisis estándares de ADN de tamaño y fluorescencia conocidos como referencias. Al establecer un umbral mínimo de fluorescencia, se excluye el ruido de fondo. ^{[ 4 ]}

El resultado de la etapa de detección láser es un electroferograma que muestra una serie de picos, con la longitud del fragmento en el eje horizontal y la intensidad de fluorescencia en el eje vertical (Figura 1). Un segundo resultado ^{[ 4 ]} es una tabla de datos que enumera el tiempo de migración de los fragmentos, el tamaño en pares de bases de cada pico y la altura y el área bajo cada pico.

La base teórica de T-RFLP asume que los picos en diferentes posiciones a lo largo del eje horizontal representan diferentes tipos de organismos (u OTU). El área bajo cada pico de intensidad de fluorescencia es un indicador de la abundancia relativa de cada filotipo en la comunidad. Sin embargo, se deben tener en cuenta varias salvedades. Diferentes tipos de organismos pueden compartir un sitio de restricción en el gen de interés; si ese es el caso, estos organismos no se distinguirían como picos diferentes en el electroferograma. Además, el área bajo un pico representa la abundancia relativa en lugar de la abundancia absoluta, y existen sesgos en la medición de la abundancia y la amplificación por PCR. Por ejemplo, los organismos que son escasos en la muestra original de ADN total no se amplificarán lo suficiente como para ser detectados en el análisis final. ^{[ 7 ]} Esto lleva a una subestimación de la diversidad de la comunidad. Liu et al. ^{[ 7 ]} citan otros posibles factores que pueden distorsionar los resultados, incluyendo "diferencias en el número de copias de genes entre especies y sesgos introducidos durante la lisis celular, la extracción de ADN y la amplificación por PCR" (p.  4521). Para aquellos que buscan información técnica detallada, Marsh ^{[ 2 ]} proporciona un catálogo de posibles sesgos que podrían introducirse en cada paso del proceso T-RFLP.

Las principales ventajas de T-RFLP son su rapidez y la facilidad para procesar numerosas muestras. ^{[ 2 ]} Además, la representación visual simplifica la comparación de los patrones de estructura de la comunidad entre diferentes muestras. Una desventaja es la naturaleza cualitativa y general de los datos obtenidos, que deben interpretarse teniendo en cuenta las advertencias anteriores. Asimismo, no es posible la identificación directa de microorganismos en una muestra mediante T-RFLP.

Disayathanoowat et al. ^{[ 8 ]} utilizaron T-RFLP para evaluar la comunidad microbiana intestinal, o microbioma, en dos especies de abejas melíferas en Tailandia. Descubrieron que las dos especies albergan comunidades microbianas diferentes y que el microbioma cambia a lo largo de la vida de las abejas.

Joo et al. ^{[ 9 ]} probaron T-RFLP como método para el monitoreo del fitoplancton. Los autores recolectaron muestras de agua ambiental de embalses en una serie temporal. Tras comparar las muestras con fragmentos de restricción terminal conocidos (de una base de datos creada a partir de cultivos), concluyeron que T-RFLP puede utilizarse eficazmente como técnica para monitorear los cambios en la comunidad fitoplanctónica. Sin embargo, se observó que las estimaciones de diversidad y abundancia eran menos precisas que las obtenidas mediante otros métodos.

La electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) es una técnica de huella dactilar microbiana que separa amplicones de tamaño similar en función de sus propiedades de secuencia ^{[ 1 ]} (Figura 2). Estas propiedades determinan el umbral de desnaturalización del ADN. El gel DGGE utiliza un desnaturalizante de ADN en gradiente (una mezcla de urea y formamida ) o un gradiente de temperatura lineal. ^{[ 10 ]} Cuando el fragmento alcanza su punto de fusión (umbral de desnaturalizante suficiente), deja de moverse. Esto se debe a que un ADN bicatenario parcialmente fundido ya no puede migrar a través del gel. ^{[ 11 ]} Se utiliza una pinza GC (aproximadamente 40 bases con alto contenido de GC) como cebador especial para anclar los fragmentos de PCR una vez desnaturalizados . ^{[ 12 ]}

Cada carril en un gel representa una comunidad microbiana. Las bandas compartidas entre las muestras son del mismo tamaño y aproximadamente de la misma posición en el gel. Las variantes genéticas que no se comparten entre las muestras de la comunidad microbiana no coinciden horizontalmente con otras. Por ejemplo, si el gen de interés es el ARNr 16S, como lo era cuando se describió la técnica por primera vez, los fragmentos amplificados por PCR estarán en la misma ubicación vertical porque todos son aproximadamente del mismo tamaño. ^{[ 13 ]} Otro gen objetivo puede tener una mayor variación en la longitud, pero el gradiente desnaturalizante utiliza un segundo elemento (el punto de fusión) para distinguir aún más entre las muestras. El gel DGGE separará los genes del mismo tamaño basándose en la secuencia de bases.

Esta técnica muestra hasta qué punto las comunidades microbianas son iguales o diferentes en su composición taxonómica. Cada banda en una ubicación diferente en el gel representa un filotipo diferente (una secuencia única de un gen marcador filogenético). ^{[ 1 ]} Para las comunidades microbianas, este método perfila muchas secuencias individuales de ARNr 16S. ^{[ 14 ]} El número de bandas en diferentes posiciones horizontales se puede utilizar para estimar el nivel de biodiversidad en esa muestra e inferir la afiliación filogenética. ^{[ 10 ]} Para saber más sobre la afiliación filogenética, se podrían extraer esas bandas del gel y luego secuenciarlas.

El uso del perfil desnaturalizante sirve para separar fragmentos de ADN de tamaños similares. Esto es beneficioso para evaluar la diversidad microbiana debido a que el gen del ARNr 16S no varía mucho de tamaño entre los filos bacterianos. El gel DGGE proporciona una forma rápida de observar la biodiversidad en una muestra microbiana y no excluye la opción de secuenciar las bandas de interés. Este método no requiere que los microbios se cultiven en el laboratorio ni datos de secuencia necesarios para diseñar sondas para métodos de hibridación. ^{[ 10 ]} La principal desventaja es que se trata de una evaluación cualitativa de la biodiversidad y es necesario secuenciar los genes para inferir el parentesco filogenético. Otra desventaja es que la pinza GC puede variar cada vez que se sintetiza. Esto conlleva la posibilidad de obtener diferentes perfiles DGGE para la misma secuencia de ARNr 16S. ^{[ 12 ]}

Stephen et al. ^{[ 15 ]} utilizaron DGGE para un análisis rápido de Proteobacteria en el suelo. Obtuvieron una evaluación inicial de la diversidad microbiana en sus muestras ambientales de suelo mantenido durante 36 años a diferentes valores de pH. Combinaron DGGE y técnicas de hibridación mediante el análisis de los fragmentos de ADN para obtener más detalles sobre las poblaciones naturales. En este estudio, analizaron un grupo de tipos bacterianos estrechamente relacionados, todos β-proteobacterias autótrofas oxidantes de amoníaco. Las muestras de ADNr 16S produjeron bandas superpuestas ambiguas al ser analizadas en un gel. Estas bandas superpuestas ambiguas se separaron con sondas radiomarcadas específicas para cada clúster, lo que proporcionó información sobre la abundancia relativa de los diferentes genotipos en las muestras.

Ward et al. ^{[ 14 ]} examinaron comunidades de tapetes cianobacterianos en una fuente termal de Yellowstone mediante el análisis DGGE de segmentos del gen ARNr 16S de poblaciones quimioorganotróficas aerobias. El DGGE les permitió perfilar la comunidad y obtener nuevos conocimientos sobre su diversidad. Caracterizaron las bandas de interés mediante purificación y secuenciación, y detectaron numerosos linajes cuya presencia se desconocía hasta entonces.

El análisis automatizado del espaciador intergénico ribosómico ( ARISA) (Figura 3) aprovecha el hecho de que el ADN procariota codifica dos genes altamente conservados: el gen del ARNr 16S y el gen del ARNr 23S. Estos genes codifican las subunidades pequeña y grande del operón del ARNr . Entre estos dos genes se encuentra una región espaciadora transcrita interna (ITS). Debido a que no codifica proteínas, su secuencia de nucleótidos y longitud son altamente variables. Una vez aislado el ADN de una comunidad, la PCR amplifica esta región espaciadora. Los fragmentos pueden analizarse mediante electroforesis en gel (RISA) o bien, los cebadores fluorescentes pueden traducirse en picos de abundancia de fragmentos de diferentes longitudes en un electroferograma (ARISA). ^{[ 16 ] [ 17 ]}

Debido a la variabilidad de las regiones no codificantes, el resultado de RISA es un gel con diferentes patrones de bandas, y el resultado de ARISA es un electroferograma con diferentes picos (similar a T-RFLP).

El brillo de los cebadores marcados con fluorescencia se correlaciona con la prevalencia de ese tipo de bacteria en la comunidad. El patrón de bandas en el gel puede interpretarse como un perfil específico de la comunidad. Cada banda o pico de ADN indica al menos un representante de ese organismo. ^{[ 16 ]} En RISA, las bandas en el gel que no coinciden en longitud representan diferentes organismos en la comunidad porque tienen diferentes regiones espaciadoras entre los dos genes altamente conservados. El electroferograma muestra picos que se correlacionan con la abundancia relativa de esa región espaciadora en la muestra.

ARISA puede tener una resolución más alta en la detección de diversidad microbiana en comparación con T-RFLP . ^{[ 18 ]} Este método de huella genética es un método rápido y sensible para estimar la diversidad microbiana. Las heterogeneidades de longitud observadas se pueden comparar con bases de datos para superponer con organismos cultivables. ^{[ 16 ]} Se pueden diseñar cebadores de oligonucleótidos a nivel de filo para abordar preguntas sobre grupos filogenéticos. ^{[ 16 ]} Una desventaja de ARISA es el hecho de que un solo organismo puede contribuir con más de un pico al perfil de la comunidad. Los organismos no relacionados también pueden tener longitudes de espaciador similares, lo que lleva a subestimaciones de la diversidad de la comunidad. Debido a estos sesgos, los investigadores a menudo utilizan este método en múltiples muestras de cada comunidad para obtener una evaluación promedio.

Ranjard et al. ^{[ 17 ]} analizan varios ejemplos de tipos de estudios en los que se puede utilizar RISA. Citan diversos estudios que han empleado esta técnica para caracterizar comunidades bacterianas tras perturbaciones como el tratamiento con antibióticos, el estrés por mercurio y la deforestación. También demuestran el éxito de ARISA en la caracterización de comunidades fúngicas, un aspecto de la ecología microbiana que aún requiere mayor investigación.

Schloss et al. ^{[ 19 ]} realizaron un estudio que examinó las variables ambientales y las relacionó con los cambios en la ecología microbiana de una pila de compost. Utilizaron ARISA para perfilar la estructura de la comunidad y observar la sucesión microbiana a lo largo de las etapas del proceso de compostaje. Tomaron muestras de ADN y secuenciaron el gen 16S rRNA para identificar a los miembros de la comunidad en las diferentes fases del proceso. Luego, utilizaron ARISA para observar los cambios en toda la comunidad y compararon la secuencia del gen 16S rRNA con los fragmentos ARISA más comunes para identificar a estos miembros de la comunidad microbiana.