DHX8

La helicasa DEAH-box 8 es una proteína codificada en humanos por el gen DHX8 . Esta proteína pertenece a la familia de polipéptidos DEAH-box . La característica principal de este grupo es su motivo conservado DEAH ( Asp - Glu - Ala - His ). ^{[ 5 ]} Una amplia gama de helicasas de ARN pertenece a esta familia. Específicamente, DHX8 actúa como una helicasa de ARN dependiente de ATP involucrada en el empalme y la regulación de la liberación de ARNm empalmados desde los espliceosomas fuera del núcleo. ^{[ 6 ]} Estudios publicados han demostrado las consecuencias de las mutaciones de DHX8 , algunas de las cuales son críticas para procesos biológicos como la hematopoyesis y están relacionadas con algunas enfermedades. ^{[ 7 ] [ 8 ]}

La proteína DHX8 forma parte de un complejo proteico llamado espliceosoma, que se encarga del empalme del pre-ARNm . El espliceosoma tiene ocho estados funcionales principales, cada uno con una composición y estructura distintas; cinco de los ocho estados han sido caracterizados estructuralmente. ^{[ 10 ]}

DHX8 tiene diferentes dominios: un dominio de unión a ARN S1 (caja DEAD/DEAH), un dominio C-terminal conservado de helicasa , un dominio asociado a helicasa (HA2) y un pliegue de unión a oligonucleótidos/oligosacáridos (OB) , cada uno unido por regiones intrínsecamente desordenadas . ^{[ 11 ]}

Existen algunas regiones de la proteína que son muy importantes para su actividad, como R620 y las regiones de bucle-gancho y giro-gancho. Además, DHX8Δ547 es el núcleo catalíticamente activo de la proteína DHX8. Está compuesto por dos dominios RecA y los dominios WH, tipo trinquete y de pliegue OB del extremo C-terminal, así como la región N-terminal . ^{[ 9 ]}

El peso total de la estructura DHX8 es de 156580,13 Da.

Estructura secundaria:

• 36% helicoidal: 26 hélices y 246 residuos
• Lámina beta del 16% : 29 hebras y 110 residuos. ^{[ 9 ]}

DHX8 se localiza en el núcleo celular y se estimula en presencia de ARN. Esta proteína es un componente del espliceosoma, por lo que participa en el empalme del pre-ARNm. ^{[ 9 ]} El empalme es el proceso de unión de exones de los transcritos primarios de ARN mensajero y la eliminación de secuencias intrónicas , mediante un mecanismo espliceosómico, de modo que el ARNm producido es aquel sin intrones, compuesto exclusivamente por los exones unidos. ^{[ 12 ]} El empalme finaliza con el desensamblaje del complejo espliceosómico y la liberación dependiente de ATP de los ARN maduros resultantes hacia el exterior del núcleo. ^{[ 13 ]} El espliceosoma requiere cambios conformacionales para poder catalizar las reacciones de empalme y la posterior liberación del ARNm maduro al exterior del núcleo. Una de las helicasas dependientes de ATP necesarias para estos cambios conformacionales es DHX8. Además, DHX8 desempeña un papel clave en la liberación, facilitando la exportación nuclear del ARNm empalmado. La caracterización de la proteína ha demostrado que DHX8 tiene preferencia de unión por el ARN rico en adenina . Esta unión va seguida de la hidrólisis de ATP y, por lo tanto, de la liberación de ADP . ^{[ 9 ]}

Mecanismo

DHX8 tiene múltiples funciones moleculares como la unión de ATP mediante interacciones selectivas y no covalentes con la coenzima y el regulador enzimático adenosín 5' trifosfato. ^{[ 14 ]} También unión a proteínas idénticas (crea un tipo de interacciones similar a las descritas anteriormente, pero con otras proteínas), unión a ARN y actividad de ARN helicasa, basada en la catálisis de la reacción que desenrolla una hélice de ARN: ^{[ 15 ]}

ATP + H ₂ O = ADP + fosfato ^{[ 16 ]}

La proteína DHX8 se expresa principalmente en el cerebro, sobre todo en el cerebelo , donde se encuentra mayoritariamente en las células de Purkinje . Otros órganos importantes donde se expresa son la próstata y la vesícula biliar , zonas en las que este polipéptido también presenta una alta expresión.

La proteína DHX8 no se expresa de forma significativa en todos los tejidos y órganos; algunos ejemplos claros son la médula ósea o el tejido blando (nervio periférico), donde no disponemos de la cantidad suficiente de proteína para ser representativos. ^{[ 17 ]}

Los ensayos en enzimología para la caracterización bioquímica de proteínas requieren altas concentraciones de la proteína de interés, y sus protocolos deben ser eficientes, sencillos y económicos para garantizar una purificación exitosa. Un ejemplo de método de purificación para DHX8 consiste en utilizar una etiqueta proteica denominada GST-His injertada en la proteína DHX8.

La etiqueta GST (glutatión sefarosa) N-terminal y la etiqueta His C-terminal , también conocida como GST-His, es una etiqueta de 29 kDa que permite la purificación por afinidad a pequeña escala de proteínas recombinantes. Este método se basa en dos etiquetas diferentes que flanquean los dos extremos de la proteína. Sin embargo, podría influir en las propiedades fisiológicas de la proteína, por lo que se requieren pruebas empíricas para cada caso. ^{[ 18 ]}

Los constructos DHX8 se generan mediante clonación por PCR utilizando enzimas de restricción. Para generar His ₆ GST-DHX8Δ54 (hexahistidina-GST), la secuencia codificante de los residuos A548 a R1220 se inserta en una versión de "pFastBac", un kit de vector específico de Thermo Fisher Scientific, ^{[ 19 ]} _{modificado para codificar una etiqueta His 6} GST N-terminal seguida de un sitio de corte de la proteasa HRV 3C (proteasa recombinante de grado de restricción). HRV 3C es una proteína de fusión 6XHis recombinante altamente purificada, que reconoce el mismo sitio de corte que la enzima nativa. Tanto el vector como el inserto se digieren con las enzimas de restricción NdeI y EcoRI .

Para crear DHX8 de longitud completa (fl-DHX8-His ₆ ) y DHX8Δ547-His ₆ ) , se diseñan cebadores de PCR de manera que una etiqueta His ₆ se fusione al extremo C-terminal de DHX8. Los amplicones de PCR resultantes que codifican fl-DHX8 (M1 a R1220) o DHX8Δ547 (A548 a R1220) se insertan en el vector "pFBDM" ^{[ 20 ]} aguas abajo del promotor de poliedrina. Tanto el vector como el inserto se digieren con las enzimas de restricción BamHI y NotI . ^{[ 9 ]}

• Resumen de toda la información estructural disponible en el PDB para UniProt : Q14562 (ARN helicasa dependiente de ATP DHX8) en el PDBe-KB .