Introducción (biología molecular)

Tras la inserción de los fragmentos de Okazaki , los cebadores de ARN se eliminan (el mecanismo de eliminación difiere entre procariotas y eucariotas ) y se reemplazan por nuevos desoxirribonucleótidos que rellenan los huecos donde se encontraba el cebador de ARN. A continuación, la ADN ligasa une las hebras fragmentadas, completando así la síntesis de la hebra rezagada. ^{[ 1 ]}

En procariotas, la ADN polimerasa I sintetiza el fragmento de Okazaki hasta que alcanza el cebador de ARN anterior. Luego, la enzima actúa simultáneamente como una exonucleasa 5′→3′ , eliminando los ribonucleótidos del cebador por delante y añadiendo desoxirribonucleótidos por detrás. Tanto la polimerización como la escisión del cebador de ARN ocurren en la dirección 5′→3′ , y la polimerasa I puede realizar estas actividades simultáneamente; esto se conoce como "Traducción de Muesca". ^{[ 1 ]} La traducción de muesca se refiere a la actividad sincronizada de la polimerasa I en la eliminación del cebador de ARN y la adición de desoxirribonucleótidos . Posteriormente, se forma un espacio entre las hebras llamado muesca, que se sella mediante una ADN ligasa .

En eucariotas, la eliminación de los cebadores de ARN en la hebra rezagada es esencial para la finalización de la replicación. Así, a medida que la hebra rezagada es sintetizada por la ADN polimerasa δ en dirección 5′→3′ , se forman fragmentos de Okazaki , que son hebras discontinuas de ADN. Luego, cuando la ADN polimerasa llega al extremo 5' del cebador de ARN del fragmento de Okazaki anterior, desplaza el extremo 5' del cebador en una solapa de ARN monocatenaria que es eliminada por la escisión de la nucleasa. La escisión de las solapas de ARN implica tres métodos de eliminación del cebador. ^{[ 3 ]} La primera posibilidad de eliminación del cebador es mediante la creación de una solapa corta que es eliminada directamente por la endonucleasa 1 específica de la estructura de la solapa (FEN-1), que escinde la solapa sobresaliente 5'. Este método se conoce como la vía de la solapa corta para la eliminación del cebador de ARN. ^{[ 4 ]} La segunda forma de escindir un cebador de ARN es degradando la cadena de ARN usando una RNasa , en eucariotas se conoce como RNasa H2. Esta enzima degrada la mayor parte del cebador de ARN hibridado, excepto los nucleótidos cercanos al extremo 5' del cebador. Así, los nucleótidos restantes se muestran en una solapa que es escindida usando FEN-1. El último método posible de eliminar el cebador de ARN se conoce como la vía de la solapa larga. ^{[ 4 ]} En esta vía se reclutan varias enzimas para alargar el cebador de ARN y luego escindirlo. Las solapas son alargadas por una helicasa 5' a 3' , conocida como Pif1 . Después de la adición de nucleótidos a la solapa por Pif1, la solapa larga es estabilizada por la proteína de replicación A (RPA). El ADN unido a RPA inhibe la actividad o el reclutamiento de FEN1, como resultado, se debe reclutar otra nucleasa para cortar el colgajo. ^{[ 3 ]} Esta segunda nucleasa es la nucleasa DNA2 , que tiene una actividad helicasa-nucleasa, que corta el largo colgajo del cebador de ARN, que luego deja un par de nucleótidos que son cortados por FEN1. Al final, cuando todos los cebadores de ARN han sido eliminados, se forman muescas entre los fragmentos de Okazaki que se rellenan con desoxirribonucleótidos usando una enzima conocida como ligasa1 , a través de un proceso llamado ligación .

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utiliza un par de cebadores específicos para dirigir la elongación del ADN uno hacia el otro en los extremos opuestos de la secuencia que se está amplificando. Estos cebadores suelen tener entre 18 y 24 bases de longitud y son complementarios a los sitios específicos aguas arriba y aguas abajo de la secuencia que se está amplificando. ^{[ 1 ]}

Los pares de cebadores se diseñan para tener temperaturas de fusión similares , ya que la hibridación durante la PCR ocurre simultáneamente en ambas hebras. La temperatura de fusión no debe ser ni mucho mayor ni mucho menor que la temperatura de hibridación de la reacción . Si las temperaturas de hibridación son demasiado bajas, pueden formarse estructuras no específicas, lo que reduce la eficiencia de la reacción. ^{[ 5 ]}

Además, es necesario elegir secuencias de cebadores que seleccionen de forma única una región de ADN, evitando la posibilidad de hibridación con una secuencia similar cercana. Un método comúnmente utilizado para seleccionar un sitio de cebador es la búsqueda BLAST , que permite visualizar todas las regiones posibles a las que un cebador puede unirse. Tanto la secuencia de nucleótidos como el propio cebador pueden ser analizados mediante BLAST. La herramienta gratuita Primer-BLAST del NCBI integra el diseño de cebadores y la búsqueda BLAST en una sola aplicación, ^{[ 6 ]} al igual que productos de software comerciales como ePrime y Beacon Designer . Se puede realizar PCR in silico para evaluar la especificidad de los cebadores diseñados. ^{[ 7 ]}

La selección de una región específica de ADN para la unión del cebador requiere algunas consideraciones adicionales. Deben evitarse las regiones con alta cantidad de repeticiones de mononucleótidos y dinucleótidos, ya que puede producirse la formación de bucles y contribuir a una hibridación incorrecta. Los cebadores complementarios entre sí pueden dar lugar a la formación de dímeros de cebadores, lo que reduce la eficiencia de la reacción deseada. ^{[ 8 ]} Los cebadores que pueden hibridar consigo mismos pueden formar horquillas y bucles internos que dificultan la hibridación con el ADN molde. ^{[ 8 ]}

Al diseñar cebadores, se pueden agregar bases de nucleótidos adicionales a los extremos posteriores de cada cebador, lo que da como resultado una secuencia de caperuza personalizada en cada extremo de la región amplificada. Una aplicación de esta práctica es su uso en la clonación TA , una técnica especial de subclonación similar a la PCR, donde la eficiencia se puede aumentar agregando colas AG a los extremos 5′ y 3′. ^{[ 9 ]}

En algunas situaciones, puede ser necesario el uso de cebadores degenerados. Estos son mezclas de cebadores similares, pero no idénticos. Pueden ser convenientes al amplificar el mismo gen de diferentes organismos , ya que las secuencias probablemente sean similares, pero no idénticas. Esta técnica es útil porque el código genético en sí es degenerado , lo que significa que varios codones diferentes pueden codificar el mismo aminoácido . Esto permite que diferentes organismos tengan una secuencia genética significativamente diferente que codifica una proteína muy similar. Por esta razón, los cebadores degenerados también se utilizan cuando el diseño del cebador se basa en la secuencia de la proteína , ya que se desconoce la secuencia específica de codones. Por lo tanto, la secuencia del cebador correspondiente al aminoácido isoleucina podría ser "ATH", donde A representa adenina , T timina y H adenina , timina o citosina , según el código genético de cada codón , utilizando los símbolos IUPAC para bases degeneradas . Es posible que los cebadores degenerados no se hibriden perfectamente con la secuencia objetivo, lo que puede reducir considerablemente la especificidad de la amplificación por PCR.

Los cebadores degenerados son ampliamente utilizados y extremadamente útiles en el campo de la ecología microbiana . Permiten la amplificación de genes de microorganismos hasta ahora no cultivados o la recuperación de genes de organismos para los que no se dispone de información genómica. Generalmente, los cebadores degenerados se diseñan alineando secuencias genéticas disponibles en GenBank . Las diferencias entre secuencias se tienen en cuenta utilizando las degeneraciones de la IUPAC para cada base. Posteriormente, se sintetizan los cebadores de PCR como una mezcla de cebadores que corresponden a todas las permutaciones de la secuencia de codones.