PCR in silico

La PCR in silico ^{[ 1 ]} se refiere a las herramientas computacionales utilizadas para calcular los resultados teóricos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando un conjunto dado de cebadores ( sondas ) para amplificar secuencias de ADN de un genoma o transcriptoma secuenciado . ^{[ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ]}

Estas herramientas se utilizan para optimizar el diseño de cebadores para secuencias de ADN o ADNc objetivo. La optimización de cebadores tiene dos objetivos: eficiencia y selectividad. La eficiencia implica considerar factores como el contenido de GC, la eficiencia de unión, la complementariedad, la estructura secundaria y el punto de hibridación y fusión (Tm) . La selectividad de los cebadores requiere que los pares de cebadores no se unan fortuitamente a sitios aleatorios distintos del objetivo de interés, ni que se unan a regiones conservadas de una familia de genes. Si la selectividad es baja, un conjunto de cebadores amplificará múltiples productos además del objetivo de interés. ^{[ 6 ]}

El diseño de pares de cebadores cortos o largos adecuados es solo uno de los objetivos de la predicción de productos de PCR. Otra información proporcionada por las herramientas de PCR in silico puede incluir la determinación de la ubicación y orientación de los cebadores, la longitud de cada amplicón , la simulación de la movilidad electroforética , la identificación de marcos de lectura abiertos y enlaces a otros recursos web. ^{[ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]}

Hay muchos paquetes de software disponibles que ofrecen diferentes equilibrios de conjunto de características, facilidad de uso, eficiencia y costo. ^{[ 10 ] [ 11 ] [ 12 ] [ 13 ] [ 14 ]} Primer-BLAST es ampliamente utilizado y de libre acceso desde el sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). Por otro lado, FastPCR , ^{[ 10 ]} una aplicación comercial, permite la prueba simultánea de un solo cebador o un conjunto de cebadores diseñados para secuencias objetivo multiplex. Realiza una alineación rápida y sin huecos para probar la complementariedad de los cebadores con las secuencias objetivo. Se pueden encontrar productos de PCR probables para plantillas lineales y circulares utilizando PCR estándar o inversa , así como para PCR multiplex . Dicey ^{[ 15 ]} es un software gratuito que genera productos de PCR in silico a partir de conjuntos de cebadores proporcionados en un archivo FASTA . Es rápido (a través del uso del índice FM de un genoma ) y puede tener en cuenta la temperatura de fusión del cebador y las distancias de edición toleradas entre los cebadores y las ubicaciones de coincidencia en el genoma. VPCR ^{[ 3 ]} realiza una simulación dinámica de PCR múltiple, lo que permite estimar los efectos de competencia cuantitativa entre múltiples amplicones en una misma reacción. El navegador genómico de UCSC ofrece isPCR , que proporciona resultados gráficos y en formato de archivo de texto para visualizar los productos de PCR en más de 100 genomas secuenciados.

Un cebador puede unirse a muchas secuencias predichas, pero solo las secuencias con pocas o ninguna discrepancia (1 o 2, según la ubicación y el nucleótido) en el extremo 3' del cebador pueden utilizarse para la extensión de la polimerasa. Las últimas 10-12 bases en el extremo 3' de un cebador son sensibles al inicio de la extensión de la polimerasa y a la estabilidad general del cebador en el sitio de unión a la plantilla. El efecto de una sola discrepancia en estas últimas 10 bases en el  extremo 3' del cebador depende de su posición y estructura local, reduciendo la unión del cebador, la selectividad y la eficiencia de la PCR. ^{[ 7 ] [ 9 ]}

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